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12- MANUAL DO IBAMA - PARTE D AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE AGENTES QUÍMICOS PARA MICRORGA-NISMOS, MICROCRUSTÁCEOS, PEIXES, ALGAS, ORGANISMOS DO SOLO, AVES ANIMAIS SILVESTRES E PLANTAS

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MANUAL DO IBAMA - PARTE D AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE AGENTES QUÍMICOS PARA MICRORGANISMOS, MICROCRUSTÁCEOS, PEIXES, ALGAS, ORGANISMOS DO SOLO, AVES ANIMAIS SILVESTRES E PLANTAS D.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PARA MICROCRUSTÁCEO D.2.1. Avaliação da toxicidade aguda para Daphnia similis (Cladocera, Crustacea) D.2.2. Avaliação da toxicidade crônica para Daphnia similis (Cladocera, Crustacea) D.2.3. Avaliação da toxicidade crônica para Ceriodaphnia dubia (Cladocera, Crustacea) D.2.1. Avaliação da
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  MANUAL DO IBAMA - PARTE D AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE AGENTES QUÍMICOS PARA MICRORGA-NISMOS, MICROCRUSTÁCEOS, PEIXES, ALGAS, ORGANISMOS DO SOLO,AVES ANIMAIS SILVESTRES E PLANTAS D.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE PARA MICROCRUSTÁCEO D.2.1. Avaliação da toxicidade aguda para Daphnia similis (Cladocera,Crustacea)D.2.2. Avaliação da toxicidade crônica para Daphnia similis (Cladocera,Crustacea)D.2.3. Avaliação da toxicidade crônica para Ceriodaphnia dubia (Cladocera,Crustacea) D.2.1. Avaliação da toxicidade aguda para Daphnia similis  (Cladocera, Crustacea) Data da revisão: 09/87 1. Objetivo Avaliar a toxicidade aguda de agentes químicos para Daphnia similis . 2. Fundamento Este método consiste na exposição de indivíduos jovens de Daphnia similis avárias concentrações do agente químico, por um período de 48 horas, nas condiçõesprescritas.Tal procedimento permite determinar a concentração efetiva inicial média CE 50 ,48 h, da substância-teste.  3. Definição3.1. Concentração efetiva inicial média - CE 50 , 48 h Concentração nominal do agente químico no início do teste, que causa efeitoagudo (imobilidade) a 50% dos organismos em 48 horas de exposição, nas condiçõesde teste. 4. Material necessário4.1. Aparelhos e equipamentos Todo material que entrará em contato com a substância-teste deverá ser quimicamente inerte, preferencialmente de vidro.Como recipientes para teste podem ser utilizados tubos de ensaio aferidos para10 ml, cuidadosamente lavados e enxaguados. 4.1.1. Medidor de pH. 4.1.2. Medidor de oxigênio dissolvido na água. 4.1.3. Agitador de tubos de ensaio. 4.1.4. Câmara incubadora com temperatura controlada para 20ºC. 4.1.5. Titulador para determinação da dureza total da água. 4.2. Soluções e reagentes4.2.1. Água de diluição Para o preparo de água reconstituída deve-se utilizar reagentes de grauanalítico. A água usada para o preparo do meio sintético deve ser srcinária de umdestilador de vidro ou água deionizada de pureza equivalente, com condutividadeigual ou menor que 10uS/cm.A água de diluição reconstituída é água mole (APHA, 1980), devendo possuir pH = 7,4 ± 0,2, dureza total de 40 a 48 mg/L em CaCO 3 e condutividade em torno de160uS/cm.Para o preparo da água de diluição são utilizadas duas soluções, abaixoespecificadas, nas seguintes proporções:  Solução 1........................................................ 20 mlSolução 2........................................................ 10 mlÁgua deionizada ou destilada....................... 970 mlAs soluções 1 e 2 são preparadas da seguinte maneira: Solução 1 Sulfato de cálcio (CaSO 4 . 2H 2 O).................. 1,50 gÁgua deionizada ou destilada....................... 1000 ml Solução 2 Cloreto de potássio (KCl).............................. 0,2 gBicarbonato de sódio (NaHCO 3 )................... 4,80 gSulfato de magnésio (MgSO 4 . 7H 2 O............ 6,10 gÁgua deionizada ou destilada....................... 4,80 gApós o preparo da água mole, introduz-se aeração durante pelo menos 24horas, para homogeneização e para que seja atingida saturação máxima de oxigênio.Se o pH estiver abaixo de 7,2 ou acima de 7,6 deverá ser ajustado com o acréscimode ácido clorídrico (HCl) 1N ou hidróxido de sódio (NaOH) 1N. A água não deve ser aerada após o ajuste de pH. 4.2.2. Soluções-estoque As soluções-estoque devem ser preparadas no momento da realização doteste, dissolvendo-se uma quantidade conhecida do agente químico, a ser testado,em um volume definido de água de diluição.Substâncias de baixa solubilidade podem ser dissolvidas ou dispersadas por intermédio de solventes que apresentam baixa toxicidade a Daphnia , desde que aconcentração final destes não ultrapasse 0,1 ml/L ou 0,1 g/L na solução-teste.No caso de emprego de solventes deverá ser preparado, por ocasião dobioensaio, além de um controle com água de diluição, um outro com a concentraçãomáxima de solvente utilizada.  Quando da utilização de solventes torna-se importante a análise química dasolução-estoque. 4.2.3. Soluções-teste Estas soluções devem ser preparadas através de misturas da solução-estoqueem água de diluição, em diferentes proporções relativas. Nas soluções-teste sãocolocados os organismos a serem estudados. 4.3. Organismos-teste Para a realização do teste devem ser utilizados organismos com 06 a 24 horasde idade, obtidos de culturas mantidas em condições controladas (Anexo I). Paraobtenção dos mesmos pode-se adotar o seguinte procedimento:a) Um dia antes de iniciar o teste, um lote de fêmeas ovígeras é separado dasculturas, utilizando-se para isso uma pipeta Pasteur com ponta arredondada, dediâmetro adequado. As fêmeas separadas são colocadas em um recipiente devidro limpo, contendo 2 litros de água de diluição. Anota-se então o horário deinício desta nova cultura e alimenta-se com um volume tal de suspensão algáceaque cada organismo disponha de 5 x 10 6 células (Anexo II).O recipiente deve ser coberto com uma tampa de vidro para evitar possíveiscontaminações pelo ar. No dia seguinte (menos de 24 horas após o início destacultura), as fêmeas adultas são retiradas com pipeta Pasteur e recolocadas nasculturas srcinais. As jovens ali eclodidas poderão, então, ser utilizadas no teste.b) Outro modo para separar as jovens é com o uso de peneiras. No caso de ensaioscom Daphnia similis pode-se utilizar jovens que atravessam uma rede com malhade 500 µ m e que ficam retidas em uma rede de malha de 360 µ m.No caso de testes com outras espécies de Daphnia o uso desta técnica ficacondicionado a um estudo prévio sobre as dimensões adequadas das malhas dasredes (ISSO, 1976).
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