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CONTROLE BIOLÓGICO DA LAGARTA DO CARTUCHO, Spodoptera frugiperda, COM BACULOVÍRUS

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CONTROLE BIOLÓGICO DA LAGARTA DO CARTUCHO, Spodoptera frugiperda, COM BACULOVÍRUS Fernando Hercos Valicente 1, Edmar de Souza Tuelher 2 INTRODUÇÃO O milho é considerado o terceiro produto agrícola do mundo,
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CONTROLE BIOLÓGICO DA LAGARTA DO CARTUCHO, Spodoptera frugiperda, COM BACULOVÍRUS Fernando Hercos Valicente 1, Edmar de Souza Tuelher 2 INTRODUÇÃO O milho é considerado o terceiro produto agrícola do mundo, sendo que a área cultivada com milho no Brasil está em torno de 12 milhões de hectares. Apesar de a cultura possuir um alto potencial de produtividade, esta é diretamente afetada pelo ataque de insetos desde o momento do plantio até a sua utilização, seja para alimentação humana ou animal. O principal método de controle utilizado em todo o mundo se baseia na utilização de inseticidas químicos, estimado entre US$ 500 e US$ 600 milhões (Cruz, 1996). Dentre o complexo de insetos que atacam a cultura, a lagarta do cartucho Spodoptera frugiperda, demanda um alto investimento para o seu controle sendo a principal praga da cultura do milho no Brasil. As larvas mais novas consomem tecidos de folha de um lado, deixando a epiderme oposta intacta. Depois de segundo ou terceiro instar, as larvas começam a fazer buracos nas folhas, se alimentado em seguida do cartucho das plantas de milho, produzindo uma característica fileira de perfurações nas folhas. A densidade de larvas no cartucho pode ser reduzida devido ao comportamento canibal deste inseto. Seu ciclo de vida é completado em 30 dias em condições de laboratório e, o número de ovos pode variar de 100 a 200 por postura/fêmea (Fig. 1A), sendo que um total de a ovos pode ser colocado por uma única fêmea. A lagarta pode atingir 2,5cm (Fig. 1B) e a fase de pupa ocorre no solo (Fig. 1C). A redução na produção de grãos é variável, sendo que o milho é mais tolerante ao ataque nos estágios iniciais de desenvolvimento. No entanto a redução na produção de grãos pode chegar a 73% em situações de ataque intenso (Hruska & Gould, 1997). O controle deste inseto no campo tem sido realizado essencialmente com inseticidas químicos, chegando a serem 1 Eng Agr, Pesq. Embrapa Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP Sete Lagoas MG, 2 Eng Agr, Bolsista Embrapa Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP Sete Lagoas MG, realizadas 10 a 14 aplicações na cultura do milho no Brasil (Valicente, observação pessoal). Em face de situações como esta, o controle biológico com entomopatógenos vem se tornando uma alternativa viável no que se refere à contaminação ambiental. A B C D Figura 1 Fases do ciclo de vida da lagarta do cartucho do milho: (A) Massa de ovos de Spodoptera frugiperda podendo-se observar a emergência de lagartas; (B) lagarta; (C) pupa e (D) danos causados em planta de milho. O controle biológico pode ser definido como sendo o uso de parasitóides, predadores e patógenos no controle de insetos. A utilização de entomopatógenos com os baculovírus como agente de controle podem controlar eficientemente este inseto a campo se usados de forma adequada. Algumas das características que os tornam desejáveis para sua utilização são a sua especificidade, são compatíveis com outros inimigos naturais e seguros aos humanos (Entwistle & Evans,1985). Adicionalmente, a utilização desses bioinseticidas não polui rios, nascentes, não possui efeito tóxico sobre aplicadores e pode agregar valor ao produto final. OS BACULOVÍRUS Os baculovírus são o grupo mais comum e mais estudado dentre os grupos de vírus patogênicos a insetos. Isto se deve ao fato de que são os vírus com o maior potencial de serem usados como agentes de controle biológico de pragas, sendo conhecidos mais de 20 grupos de vírus patogênicos a insetos (Martignoni & Iwai, 1986). Os baculovírus pertencem à família Baculoviridae. Essa família é composta de vírus com uma simples fita dupla circular de DNA, que infectam um grande número de artrópodes e contém gêneros: os nucleopoliedrovírus (VPN) e os granulovírus (VG). Todos os baculovírus têm uma mesma estrutura básica: um capsídeo coberto de forma arredondada. O nucleocapsídeo é um core cilíndrico de DNA e proteína. Dentro do nucleocapsídeo, a fita dupla de DNA associa-se heterogeneamente com uma proteína básica e forma um core cilíndrico. O gênero VPN é caracterizado por possuir dois subgêneros: Vírus de Simples Nucleocapsídeo - SNPV, onde apenas um capsídeo é encontrado por envelope e aqueles chamados de Vírus de Múltiplos Nucleocapsídeos - MNPV, no qual vários nucleocapsídeos são encontrados em um envelope comum (Fig. 2A e 2B). Os VGs possuem apenas um capsídeo por envelope, possuem as oclusões virais na forma de grânulo, contendo um e raramente dois ou mais virions por grânulo (Fig. 2C) (Hunter-Fujita et al., 1998). Essa divisão da família Baculoviridae segue a classificação atual do Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (Murphy et al., 1995; ICTVdB, 2006) e está representada esquematicamente na Figura 3. As figuras 2D e 2E ilustram tecidos de S. frugiperda infectadas experimentalmente por um nucleopoliedrovírus. Poliedros Vírion Poliedrina Grânulo A B C Capsídeo Vírion Poliedro Núcleo Núcleo D E Figura 2- Micrografia eletrônica de tecido de lagartas do cartucho infectadas, S. frugiperda experimentalmente. (A) e (B): infecção por um isolado de nucleopoliedrovírus (MVPN), podendo-se observar os poliedros, os vírions e a matriz protéica de poliedrina. Notar que vários nucleocapsídeos estão envoltos por uma membrana comum; (C): granulovírus (VG), onde se é observado apenas um capsídeo por envelope protéico; (D) e (E): tecidos infectados por nucleopoliedrovírus, podendo-se observar células contendo em seus núcleos vírions e poliedros (Fotos: E.W. Kitajima). Figura 3- Representação esquemática da classificação dos baculovírus (modificado de Almeida, 2005). A oclusão das partículas virais em matriz protéica é uma característica extremamente importante, pois é o que garante proteção e possibilita a transmissão horizontal do vírus, ou seja, de um inseto para outro (Blissard & Rohrmann, 1990). As oclusões virais, portanto, são estruturas de resistência permitindo que os vírus mantenham a infectividade mesmo fora do hospedeiro (Hunter-Fujita et al., 1998). Além disso, é o permite a obtenção de formulações de bioinseticidas que podem ser armazenados até serem utilizados para o controle de pragas no campo. Infecção e modo de ação dos baculovírus Os baculovírus possuem dois tipos de progênies infecciosas: uma forma oclusa do vírus responsável pela transmissão de inseto para inseto, enquanto a forma não oclusa é responsável pela transmissão de célula para célula, em um mesmo indivíduo (Granados & Federici, 1986). A rota principal de infecção dos baculovírus é via ingestão dos poliedros e a penetração dos vírus através das células epiteliais do intestino médio dos insetos. Com a ingestão dos poliedros pelos insetos, a matriz protéica é dissolvida no intestino médio devido ao ph ser fortemente alcalino (8-11). Com a dissolução da matriz protéica, há a liberação dos vírions no lúmen digestivo e as partículas infectivas penetram nas células epiteliais do intestino médio, mediada por receptores específicos. Os nucleocapsídeos são transportados ao núcleo, liberando o seu DNA, iniciando o processo de replicação viral. A replicação do vírus produz a forma não oclusa do vírus que passa a infectar os demais tecidos. A forma oclusa somente é produzida nos estágios finais da infecção viral onde os vírions são envelopados e produzidos os poliedros. Nos estágios finais ocorre a ruptura das células e a liberação dos poliedros. É onde acontece a morte do inseto seguido da liquefação dos tecidos (Federici, 1997, 1999). Os sintomas típicos da infecção vão desde mudanças comportamentais a morfológicas e que levam a morte do inseto após alguns dias. Pode ser observada redução na alimentação e diminuição do crescimento, descoloração do tegumento e ao morrer, rompimento do tegumento do inseto, o que vem a liberar os poliedros no ambiente, possibilitando novos ciclos de infecção (Federici, 1997, 1999). Uma visão simplificada do ciclo de infecção é mostrada na figura 4. Figura 4- Infecção de um inseto hospedeiro por baculovírus (adaptado de Szewczyk et al., 2006) Baculovirus spodoptera PARA O CONTROLE DA LAGARTA DO CARTUCHO Os trabalhos com o baculovírus para o controle da lagarta do cartucho na Embrapa Milho e Sorgo iniciaram em Foi realizado um levantamento dos principais inimigos naturais deste praga em diversas regiões produtoras de milho do estado de Minas Gerais, incluindo o Sul de Minas, Vale do Rio Doce e Alto Paranaíba. Durante o levantamento, entre 1984 e 1989, foram coletadas mais de lagartas, onde foram encontrados diversos parasitóides das ordens Diptera e Hymenoptera, incluindo várias lagartas mortas por vírus (Valicente, 1989). Este levantamento se estendeu até o estado do Paraná, onde foi detectado um alto índice de lagartas parasitadas e mortas por vírus (Valicente & Barreto, 1999). Atualmente o banco de baculovírus conta com 22 isolados amostrados em diversas regiões do Brasil. Estes isolados foram estudados, caracterizados e sua eficiência avaliada em relação à lagarta do cartucho (Barreto et al., 2005). Dentre os isolados mais estudados e eficientes no controle desta praga, o isolado 19 já teve seu genoma totalmente seqüenciado (Wolff et al., 2008). Este seqüenciamento é muito importante para que se saiba a estrutura, seqüência e função de cada gene. A linha de pesquisa atual está voltada para o desenvolvimento de um sistema de produção que possibilite a obtenção de um bioinseticida a base do baculovírus que infecta a lagarta do cartucho, o vírus da poliedrose nuclear de Spodoptera frugiperda (SfMNPV), ou Baculovirus spodoptera. Vários avanços foram obtidos durante a evolução do projeto de pesquisa, mostrando a possibilidade de produção em larga escala do bioinseticida. Produção de baculovírus em larga escala A produção em larga escala do B. spodoptera é realizada em laboratório utilizando-se lagartas sadias criadas artificialmente como hospedeiro. As lagartas necessitam ser de tamanho uniforme para propiciar que a infecção das lagartas seja eficiente, facilitando o processo de coleta das mesmas após mortas. As lagartas devem ser infectadas em um tamanho ideal (7 dias de idade) para que produzam uma maior quantidade de poliedros/lagarta e, conseqüentemente haja a redução do número de lagartas equivalentes, que é o número de lagartas necessárias para pulverizar 1 hectare. A temperatura é um dos fatores mais importantes durante todo o processo de produção, sendo que todos os ambientes dentro uma biofábrica devem ter a temperatura controlada. Faz-se necessário o uso de ar condicionado e aquecimento (onde necessário) com a ajuda de circuladores de ar para que as temperaturas se igualem dentro das salas de multiplicação. A umidade relativa do ar deve ser mantida dentro das salas, para que não haja ressecamento da epiderme dos insetos. A sala de criação do inseto hospedeiro sadio deve ficar separada fisicamente do local de infecção com o baculovírus e do local das coletas de larvas mortas. A separação é importante para que não ocorra contaminação indesejada dos insetos sadios. Para a produção do B. spodoptera em larga escala, dois fatores são limitantes: o primeiro fator que afeta a produção do baculovírus é a liquefação do tegumento da lagarta imediatamente após a sua morte (Fig. 5). Este fator é crucial pelo fato de que as larvas morrem e se liquefazem, fazendo com todo o líquido interno se extravase. Deste modo, há a necessidade de se congelar as lagartas mortas para que depois as mesmas sejam coletadas com pinças e congeladas novamente até o processamento e formulação. Este fator implica em maior gasto de mão de obra, energia, freezers o que resulta em um produto final com preço mais elevado. Os baculovírus que matam a lagarta do cartucho apresentam dois genes, catepsina e quitinase, que são responsáveis pelo rompimento do tegumento da lagarta imediatamente após a sua morte (Hawtin et al., 1997). O isolado 6 (Fig. 5) pertencente ao Banco de baculovírus da Embrapa Milho e Sorgo, apresenta uma característica única de não causar o liquefação do tegumento imediatamente após a sua morte (Valicente et al., 2007, Valicente et al., 2008). Figura 5 - Lagartas de Spodoptera frugiperda mortas por Baculovirus spodoptera. À esquerda observam-se lagartas em que houve o rompimento do tegumento e à direita as lagartas infectadas com o isolado que não causa o rompimento imediato do tegumento após a morte. Outro fator importante que deve ser considerado num sistema de produção em larga escala é que a lagarta do cartucho é canibal. Após o quinto dia de idade, as lagartas devem ser separadas em copos plásticos, contendo dieta artificial. Este fator faz com que haja necessidade de mais mão de obra para a separação das lagartas e, ao mesmo tempo demanda um espaço maior de laboratório para que possa comportar todos os insetos a serem infectados pelo baculovírus. Dessa maneira, um dos objetivos a serem alcançados são a diminuição da perda devido ao canibalismo e a eliminação do processo de individualização de lagartas no sistema produtivo. Os testes realizados na tentativa de diminuir o canibalismo têm dado alguns indicativos do que pode ser utilizado como estratégia para diminuição do custo produtivo. Os trabalhos iniciais visavam à utilização de plantas que como alimento alternativo viesse a minimizar o canibalismo. Como fonte de alimento alternativo foi testado folhas de mamona, Ricinus communis (Valicente et al., 2007). Estes autores verificaram que o canibalismo foi significativamente reduzido quando as lagartas permaneceram juntas por até 96h. Posteriormente foi verificado qual era a melhor idade das lagartas para se efetuar a inoculação do vírus que maximizasse a produção (Andreazza et al., 2007). Para isso se utilizou folhas de mamona e milho e 300 lagartas de 6, 7 e Canibalismo (%) Lagarta equivalente (un.) 8 dias de idade por recipiente plástico de base circular com 5 litros de capacidade, deixando-se as lagartas se alimentarem durante 48 horas das folhas contaminadas com o vírus. Os resultados mostram o menor canibalismo naquelas que se alimentaram de folhas de mamona (Fig. 6a) independente da idade, mas o índice lagarta equivalente por hectare foi igual entre os substratos (Fig. 6b) Porém verificou-se que este índice foi muito menor quando as lagartas apresentaram 6 e 7 dias de idade se comparadas aquelas de cinco dia, independente do substrato utilizado. 60 A Mamona Milho 600 B Mamona Milho 50 a b 300 a b b 0 5 dias 6 dias 7 dias 0 5 dias 6 dias 7 dias Inoculação (Dias após a eclosão) Inoculação (Dias após a eclosão) Figura 6- Canibalismo e lagarta equivalente (LE) em lagartas de S. frugiperda de diferentes idades infectadas com B. spodoptera inoculado em folhas de milho e mamona. Médias de substratos com letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey a 5%. Em seguida foi verificado qual seria o comportamento se as lagartas fossem mantidas em condições de alta densidade populacional quando deixadas se alimentarem por um período de até 72 horas. Neste caso, usaramse recipientes de 20 litros e 700 lagartas de 6 e 7 dias em cada um (Tuelher et al., 2007). Foi verificado maior canibalismo em milho após 72 horas nas duas idades. Quanto ao número de lagartas para a obtenção de uma dose do bioinseticida (LE), em média, foi maior para lagartas alimentadas com milho, e para lagartas com sete dias de idade (Fig. 7a e b), sugerindo que a inoculação em mamona poderá vir a propiciar maior rendimento na produção. No entanto, sabe-se das dificuldades e desvantagens associadas ao uso de folhas no processo produtivo. Além da demanda de plantas para inoculação, sujeitaria o processo produtivo a maior possibilidade de contaminação. No entanto, os resultados sugerem que pesquisas devam ser viabilizadas para verificar que fatores podem estar associados à redução do canibalismo observada. A B Figura 7- Canibalismo e lagarta equivalente de lagarta de S. frugiperda com 6 e 7 dias de idade em folhas de milho e mamona inoculadas com B. spodoptera por 48 e 72 horas. Multiplicação de B. spodoptera em hospedeiro alternativo não canibal Outro passo importante foi conseguir multiplicar o isolado 6 (que não rompe o tegumento do inseto) em lagartas de S. exígua. Esta espécie é um hospedeiro não canibal, sendo uma alternativa para a multiplicação e produção do baculovírus visando diminuir os custos de produção do bioinseticida. Porém, pode haver a produção de formas latentes, ocorrerem mutações ou redução na produtividade por lagarta ou ainda redução na taxa de infecção após várias passagens seriais em hospedeiro alternativo. Dessa forma, foi realizada em laboratório a multiplicação do vírus de S. frugiperda (SfMNPV) em S. exigua. No sistema de produção de bioinseticida espera-se que o material proveniente dessa passagem possa ser utilizado no campo. Essa multiplicação do baculovírus em S. exigua não mostrou diferença significativa no número de lagartas equivalente (LE) por dose no hospedeiro alternativo se comparado a LE para S. frugiperda (Tuelher et al., 2008). A mortalidade em S. frugiperda, no entanto, foi 6% menor com o vírus multiplicado em S. exigua, o que pode demandar que a dose a ser utilizada deva ser ajustada para um controle satisfatório (Fig. 8). Este é a segunda passagem no hospedeiro alternativo (SE- SF), portanto, o material testado é aquele que deverá ser aplicado no campo. A baixa mortalidade observada foi devido ao fato da criação massal ter sido realizada na temperatura de 28 ºC, o que propiciou um desenvolvimento acelerado das lagartas. Porém este ajuste está sendo realizado para que possa ser obtido um índice mais alto de eficiência. Portanto, tem-se o indicativo de que é viável a produção em S. exigua, pois na segunda passagem no hospedeiro alternativo não foi observada diferença significativa na mortalidade de S. frugiperda, o que indicaria possíveis alterações na estrutura e virulência do vírus (Fig. 8) 2D Graph Mortalidade LE Mortalidade (%) Lagartas equivalente SF-SF SE-SF SE-SE Espécie 0 Figura 8 Mortalidade e número de lagartas equivalente por dose em lagartas inoculadas com SfMNPV após multiplicação em S. frugiperda (SF) e S. exígua (SE). Estabilidade de B. spodoptera formulado em pó molhável As condições de armazenamento poderão afetar a infectividade do baculovírus. Assim o tempo de prateleira de um produto biológico deve ser determinado a fim de que possa ser utilizado com segurança, obtendo-se a eficiência de controle desejada. Foi verificada a eficiência do baculovírus com a utilização de dois materiais inertes distintos: caolin e zeólita. Após um ano de armazenamento foi observado que não houve diminuição da eficiência de controle de lagartas de S. frugiperda, não havendo diferença significativa entre os tempos de avaliação ou materiais inertes utilizados na formulação (Fig. 9). Observou-se, na média, maior eficiência na concentração de 4x10 7 poliedros/ml (89,7%) do que na de 4x10 6 poliedros/ml (98,7%). Mortalidade (%) Caolin- 0 Caolin - 1 ano Zeólita- 0 Zeólita- 1 ano x10 6 PIBs/mL 4x10 7 PIBs/mL Concentração Figura 9 Mortalidade de lagartas de S. frugiperda inoculadas com B. spodoptera formulado em pó molhável, em dois tipos de material inerte, mantido em condições de armazenamento durante um ano. O tipo de formulação utilizada é a mais simples, sendo que aprimoramento é uma das vertentes do projeto. A adição de adjuvantes e protetores contra radiação ultravioleta poderá contribuir para a manutenção da eficiência no campo. RESULTADOS DE EXPERIMENTOS DE CAMPO Alguns isolados de baculovírus são muito eficientes em controlar a lagarta do cartucho em laboratório (Barreto et. al., 2005) e a campo (Valicente e Costa, 1995). De um modo geral os baculovírus podem ser aplicados usando trator ou pulverizador costal. A pulverização deve ser realizada na parte da tarde (após as 16h) evitando-se assim uma maior incidência de raios ultravioleta. Deve ser usada uma vazão adequada (acima de 200L/ha) e espalhante adesivo para garantir uma melhor aderência do produto pulverizado e melhor cobertura das folhas da p
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