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DEFICIÊNCIA DE C1s E C1r HUMANA ASSOCIADA AO DESENVOLVIMENTO DE LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO MARIANE TAMI AMANO

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DEFICIÊNCIA DE C1s E C1r HUMANA ASSOCIADA AO DESENVOLVIMENTO DE LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO MARIANE TAMI AMANO Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas IV da Universidade
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DEFICIÊNCIA DE C1s E C1r HUMANA ASSOCIADA AO DESENVOLVIMENTO DE LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO MARIANE TAMI AMANO Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas IV da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências (Imunologia). São Paulo 2006 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download. DEFICIÊNCIA DE C1s E C1r HUMANA ASSOCIADA AO DESENVOLVIMENTO DE LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO MARIANE TAMI AMANO Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas IV da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências (Imunologia). Área de Concentração: Imunologia Orientadora: Prof. Dr a. Lourdes Isaac São Paulo UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS Candidata: Mariane Tami Amano Dissertação: DEFICIÊNCIA DE C1s E C1r HUMANA ASSOCIADA AO DESENVOLVIMENTO DE LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO Orientadora: Lourdes Isaac A Comissão Julgadora dos Trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a / /, considerou ( ) Aprovada ( ) Reprovada Examinador (a): Assinatura Nome Instituição Examinador (a): Assinatura Nome Instituição Presidente (a): Assinatura Nome Instituição 2 Aos meus pais, pelo apoio em todos os sentidos e por todo amor Às minhas irmãs, pela compreensão e carinho Ao meu tio Norio, pelo incentivo e por ser um exemplo de luta 3 Aos pacientes IV-1, 2, 3 e 4 e aos seus pais, pelo esforço e colaboração 4 Agradecimentos À Dra. Lourdes Isaac por ter me dado a oportunidade de aprender desde a iniciação científica e pela companhia, confiança e presença que foram imprescindíveis para todas as conquistas que tive nesses cinco anos. Ao Dr. Shaker Chuck Farah do Departamento de Bioquímica da USP, pela disposição a sempre nos ajudar. À Dra. Virgínia Paes Leme Ferriani da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, por ter sido o contato com os pacientes e pela colaboração. Às Dras. Ana Elisa Azzolini e Ana Isabel Assi-Pandochi da Faculdade Farmacêuticas da USP de Ribeirão Preto, pela colaboração. Ao Dr. Jens Jensenius da Universidade de Aarhus, Dinamarca e ao Dr. Anders Sjölholm da Universidade de Lund, Suécia, pelas dosagens de proteínas. À Edimara da Silva Reis por ter sido minha irmã mais velha do laboratório: sempre me ensinando e fazendo companhia nos momentos difíceis. E por ser uma grande amiga. À Marlene Pereira de Carvalho Florido, por todas as técnicas que me ensinou, desde a iniciação científica, pelo carinho e pelos abraços que sempre me deram força quando eu precisei. Ao Dr. José Alexandre Barbuto, Dra. Maristela Martins de Camargo e Dra. Ises Abrahamson por manterem as portas de seus laboratórios abertas para utilizarmos equipamentos e materiais. E aos membros dos respectivos laboratórios por serem sempre muito solícitos. Ao Dr. Antônio Condino Neto por estar sempre a disposto nos ajudar e pelas oportunidades de discussão sobre este trabalho. 5 Às amigas pós graduandas: Cíntia Raquel Bombardieri e Juliana Sayuri Kuribayashi por toda ajuda que me deram, pela grande paciência e acima de tudo pelos bons momentos de desconcentração. Às outras irmãs de laboratório Gisele Baracho, Dayseanne Araújo Falcão, Maria Isabel Vendramini e Lorena Bávia por todo incentivo e carinho. Aos companheiros de laboratório que, independente do tempo de convivência, me ajudaram em diversos momentos: Priscilia Aguilar, Alda Silva, Arthur Neves, Fábio Lin, José Antônio Albuquerque E aos que passaram pelo laboratório durante esses cinco anos, e certamente me ensinaram muito: Axel Ulbrich, Patrícia Ferreira de Paula, Vitor Rodrigues, Caroline Fernandes, Raphael Pigozzo, Maria Amélia Leal e Benício Pereira. Às secretárias Valéria, Jotelma e Eny, pela eficiência e pela grande paciência para esclarecer dúvidas. Aos amigos do Departamento de Imunologia do ICB da USP pelas discussões científicas, pela solidariedade em diversos momentos e por tornarem o local de trabalho um ambiente mais prazeroso. Aos funcionários da portaria, segurança, da limpeza, do áudio-visual, da biblioteca, da secretaria de pós-graduação, tesouraria, importação entre outros do ICB, que permitiram a realização deste trabalho em diversos aspectos. Aos amigos da graduação pelas discussões científicas, filosóficas e pela amizade, que me ajudaram durante o mestrado: Márcio Tomiyoshi, Viviane Jono, Luciana Osaki, Mayumi Sasaki, Marcella Sobral, Nathália Azevedo e Luiz Zangrande. À agência financiadora de pesquisa CNPq pela bolsa durante o mestrado. 6 Se as coisas são inatingíveis... ora! Não é motivo para não querê-las... Que triste os caminhos, se não fora A presença distante das estrelas Mário Quintana 7 RESUMO AMANO, M.T. Deficiência de C1s e C1r associada ao desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico. Dissertação (Mestrado em Imunologia) Instituto de Ciência Biomédicas, Universidade de São Paulo, A deficiência de proteínas do complemento pode resultar da síntese diminuída, parcial ou total, das mesmas, ou de um produto não funcional, causando maior suscetibilidade a infecções bacterianas. No caso das proteínas da via clássica (C1q, C1r, C1s, C2 e C4) a deficiência está freqüentemente relacionada ao desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença auto-imune que apresenta como sintomas erupções na pele, artrite e glomerulonefrite, acompanhadas por deposição de imunocomplexos em diversos tecidos. A deficiência de C1s é, em geral, combinada com a deficiência de C1r e dos 15 casos da deficiência de C1r/C1s, 9 estão associados ao desenvolvimento de LES. No presente trabalho, descrevemos a deficiência de C1r/C1s de uma paciente de 25 anos que apresenta LES e teve repetidas infecções bacterianas, e de seu irmão de 24 anos que também desenvolveu LES. Além disso, os outros dois irmãos, assintomáticos até o momento, também apresentaram a deficiência de C1r/C1s, enquanto os pais consangüíneos são normais para tal característica. A deficiência de C1s foi inicialmente observada por imunodifusão do soro dos pacientes e anti-c1s humano, e confirmada por eletroimunoensaio ( rocket ), quando se observou valores muito baixos de C1s ( 2,1 µg/ml). Já a presença de C1r foi observada pela imunodifusão e Western blotting, no entanto, a concentração de C1r no soro dos pacientes (~15 µg/ml), detectada por eletroimunoesaio, estava abaixo dos valores normais (48 µg/ml). Os soros dos pacientes não apresentaram qualquer atividade hemolítica mediada pela via clássica do complemento (CH50), enquanto os pais apresentaram níveis normais desta atividade. As atividades da via alternativa e das lectinas estavam presentes no soro de todos os familiares, assim como outras proteínas do sistema complemento (C3, C4, C2, fator H, fator I, fator B, MBL e MASP-2), embora a concentração de alguma delas estivesse acima do normal (C3 1500 µg/ml; C4 600 µg/ml; MBL 0,5 µg/ml). A deficiência de C1s foi confirmada por 8 Western blotting, quando C1s estava ausente no soro e no sobrenadante de culturas de fibroblastos dos pacientes. E pela microscopia confocal observamos uma falha na síntese da mesma. A análise do RNAm por RT-PCR revelou a presença de dois transcritos (~3,2 kb, ~3,1 kb) em diferentes tipos celulares de indivíduos C1s suficientes (fibroblastos, macrófagos e células de hepatoma). Através do seqüenciamento demonstramos pela primeira vez onde esses transcritos diferenciam-se: região do cdna ausente no transcrito menor. Além disso, observamos um terceiro transcrito (~2,9 kb) nos pacientes, que não apresenta o éxon 3. Este transcrito, provavelmente também está presente em indivíduos normais, porém, em uma proporção menor comparando com a concentração dos outros transcritos. A ausência do éxon 3 gera um códon de parada prematuro na posição 330 do cdna, logo após o códon que sinaliza para o início da tradução (ATG), o que impossibilita a tradução completa de C1s por este transcrito. Através do C1s dos pacientes, encontramos uma substituição C 938 Gque gerou um códon de parada prematura, impedindo a tradução completa da proteína e explicando a deficiência da proteína C1s. Também seqüenciamos o cdna de C1r, mas não encontramos nenhuma mutação que pudesse ser a causa da deficiência da mesma, o que indica que a diminuição de C1r pode ter uma regulação dependente de C1s. Esses resultados representam o primeiro caso brasileiro (e o quarto estudo molecular) da deficiência de C1s/C1r, associada ao desenvolvimento da doença auto-imune LES. PALAVRAS-CHAVES: Complemento. C1r. C1s. Lúpus eritematoso sistêmico. Doença auto-imune. Imunodeficiência. 9 ABSTRACT AMANO, M.T. IMPAIRMENT IN C1S SYNTHESIS IS ASSOCIATED WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS DEVELOPMENT. MASTER THESIS (IMMUNOLOGY) INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS, UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, Introduction and Objectives: Classical pathway complement deficiency (D) is commonly associated with autoimmune diseases development. The C1sD is often combined with C1rD and 9 of the 15 reported cases present systemic lupus erythemathosus (SLE). In the present work, we describe a girl with severe SLE and recurrent infections (pneumonias, sinusitis and septic arthritis), one brother with mild SLE and two other healthy brothers. The molecular basis responsible for the lack of C1s in the deficient patients was investigated. Methods and Results: Complement-dependent hemolytic activity was normal when stimulated by the alternative and lectin pathways, but it was absent when mediated by the classical pathway in the 4 patients. When we analyzed C1s and C1r concentrations in the family sera by ELISA we observed that C1s was undetectable in the sera of the four children, while C1s levels detected in the parents sera ( 26 _g/ml) were lower than that observed in the normal control (34 _g/ml). Moreover, levels of C1r observed in patients ( 18 _g/ml) and parents ( 35 _g/ml) sera were lower than that observed in the normal control (48 _g/ml). The concentrations of other complement proteins (C3, C4, C2, MBL and MASP-2) were normal in the patients and family members. The lack of C1s synthesis, but not of C1r, was confirmed in patients fibroblasts when analyzed by confocal microscopy. To analyze the C1s and C1r mrna expression we used RT-PCR. When we amplified nucleotides of the C1s mrna of the 4 patients we found two products: one with the expected size (385 bp) and the other with 208 bp deletion, which corresponded exactly to exon 3. This deletion generates a stop codon immediately after the initiation codon (ATG) and it was not observed in patients C1s gene and suggests a splicing error in C1s gene. This product was observed in normal individual only when we used a more sensible staining. We also found a substitution of C G at position 938 of C1s cdna in the patients C1s, which generates 10 a stop codon at this position. Moreover. the parents presented a heterozygous pattern, which explains the absence of the protein c1s in the children. Conclusion: We confirmed the existence of 3 transcripts of C1s mrna in normal individual. And we described a new case SLE associated with of C1sD combined with C1rD, caused by a substitution of C G at position 938 of cdna. Financial support: CNPq Key words: Complement. C1s. C1r. Immunodeficiency. Systemic Lupus Erythematosus. Autoimmune disease. 11 LISTA DE ABREVIATURAS ANA - Anticorpo antinuclear AP50 - ensaio hemolítico da via alternativa que compara valores obtidos para 50 % de lise no soro. BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indoil fosfato BRAGID Grupo Brasileiro de Imunodeficiências C4BP - do inglês C4b binding protein Ca ++ - íon calcio CaCl 2 cloreto de cálcio CCP - do inglês complement control protein CD do inglês cluster of differentiation cdna DNA complementar CFD - do inglês complement fixation test dilution CH 2 cadeia pesada 2 CH50 ensaio hemolítico da via clássica que compara valores obtidos para 50 % de lise no soro. CR -1/2/3/4 - receptor de complemento CTLA-4 do inglês cytotoxic T lymphocyte antigen-4 CUB 1/2 repetição homóloga reconhecida em: C1r/C1s, Uegf e na proteína morfogenética de osso humano (Bone marrow) DAF do inglês decay-accelerating factor DMEM do inglês Dulbbeco s Modified Eagle s Medium DNA - Ácido desoxirribonucléico dntp - desorribonuleotídeo trifosfatado EGF domínio descrito em epidermal growth factor EGTA ácido etileno glycol tetracético EtOH etanol fb - fator B FcγR IIA/IIB/IIIB receptores Fcγ fd fator D fh fator H fi fator I GAPDH gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase GVB do inglês gelatin veronal buffer HEL do inglês hen-egg lysozyme HepG2 célula de hepatoma HLA Antígeno leucocitário humano IDP - imunodeficiência primária IFN-γ interferon γ Ig - Imunoglobulina IGF-1 - do inglês insulin like growth factor-1 IGFBP-5 do inglês insulin like growth factor binding protein-5 IL 1/6 - interleucina K 2 HPO 4 fosfato de potássio dibásico KH 2 PO 4 fosfato de potássio monobásico LE - Lúpus eritematoso LES - Lúpus eritematoso sistêmico LPS - lipopolissacarídeo MAC complexo de ataque à membrana Map19 - do inglês mannose associated plasma protein of 19 kda MASP 1/2/3 do inglês MBL-associated serino protease MBL lectina ligadora de manose MCP - do inglês membrane cofactor protein Mg ++ - íon magnésio MgCl 2 cloreto de magnésio NaCl - cloreto de sódio NaOAc - ácido acético NBT tetrazólio nitroazul PBS - do inglês phosphate buffer saline 12 PCR do inglês polymerase chain reaction PD-1 - do inglês programmed cell death-1 RCA do inglês regulators of complement activation RNA ácido ribonucléico RPMI - Roswell Park Memorial Institute RT-PCR do inglês reverse transcriptase - polymerase chain reaction SBF soro bovino fetal SCR - do inglês short consensus repeat SDS dodecil sulfato de sódio shel - do inglês hen-egg lysozyme soluble form SP serino-proteolítico TBE do inglês Tris Buffer EDTA TBST do inglês Tris-Buffered SalineTween 20 TE - do inglês Tris- EDTA TNF-α fator de necrose tumoral - α U unidades Uegf - do inglês urchin epidermal growth factor 13 LISTA DE SÍMBOLOS AMINOÁCIDOS Cisteína Arginina Lisina Alanina Cys Arg Lys Ala BASES NITROGENADAS DOS NUCLEOTÍDEOS Adenina Timina Guanina Citosina A T G C 14 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Via alternativa do sistema complemento. 6 Figura 2. O complexo C1 é composto por uma molécula de C1q, C1r e C1s. 7 Figura 3. Via clássica do sistema complemento. 8 Figura 4. Via das lectinas do sistema complemento. 10 Figura 5. Reguladores das vias clássica, das lectinas e alternativa 16 Figura 6. Estrutura modular de C1r e C1s. 22 Figura 7. Disposição de éxons e íntrons nos genes C1s e C1r. 23 Figura 8. Hipótese da remoção de células apoptóticas. 35 Figura 9. Hipótese da indução da tolerância. 37 Figura 10. Heredograma da família portadora de deficiência de C1s. 41 Figura 11. Deficiência da proteína C1s. 51 Figura 12. Investigação da presença de C1s e C1r por Western Blotting. 56 Figura 13. Fibroblastos observados por microscopia confocal. 58 Figura 14. Análise de fibroblastos por microscopia confocal. 59 Figura 15. Expressão de dois transcritos de RNAm do C1s. 60 Figura 16. Diferença de nucleotídeos dos dois transcritos de C1s humano. 61 Figura 17. Expressão do RNAm de C1r e C1s analisado por RT-PCR. 63 Figura 18. Seqüenciamento do cdna do C1s da paciente IV Figura 19. Seqüência do cdna do C1s que não apresenta o éxon Figura 20. Presença do éxon 3 de C1s no DNA genômico dos pacientes. 65 Figura 21. Seqüenciamento do cdna do C1s da paciente IV Figura 22. Substituição de C G na posição 938 do cdna nos pacientes. 67 Figura 23. Expressão de um transcrito menor de C1s em indivíduos normais. 68 Figura 24. Expressão de diversos transcritos de RNAm nos pacientes 69 15 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Critérios diagnósticos do LES de acordo com o Colégio Americano de Reumatologia. 2 Quadro 2. Auto-anticorpos presentes no desenvolvimento de LES. 3 Quadro 3. Aspectos Clínicos do Grupos de Imunodeficiências Primárias. 25 Quadro 4. Os 10 sinais de alerta para imunodeficiência primária. 26 Quadro 5. Deficiências de algumas proteínas do sistema complemento. 27 Quadro 6. Deficiência de C1r e C1s Quadro 7. Seqüência dos primers utilizados na RT-PCR, PCR e no seqüenciamento LISTA DE TABELAS Tabela 1. Avaliação da atividade funcional da via clássica, alternativa e das lectinas no soro. 53 Tabela 2. Determinação por eletroimunoensaio da concentração das proteínas C1r e C1s no soro dos pacientes. 54 Tabela 3. Determinação da concentração de proteínas do complemento por imunodifusão radial e ELISA SUMÁRIO I. INTRODUÇÃO... I.1. Lúpus Eritematoso Sistêmico... I.2. Sistema Complemento... I.2.1. Via Alternativa...5 I.2.2. Via Clássica...7 I.2.3. Via das Lectinas...9 I.2.4. Funções Biológicas das Proteínas do Sistema Complemento...10 I.2.5. Outras Funções de C1r e C1s...13 I.2.6. Proteínas Reguladoras do Sistema Complemento...14 I Reguladores Plasmáticos 17 I Reguladores Associados à Membrana Celular...19 I.2.7. Componentes C1r e C1s...20 I.2.8. Regulação da Expressão de C1s e C1r...24 I.3. Imunodeficiências Primárias... I.4. Deficiência de Componentes da Via Clássica... I.4.1. Deficiência de C1r e C1s...28 I.5. Complemento e LES... II.OBJETIVOS 39 III. RESULTADOS.40 III.1 Pacientes... III.2. Análise da Atividade do Sistema Complemento... III.3. Detecção de Proteínas... III.4. Análise por Western Blotting... III.5. Cultura de Células... III.6. Microscopia Confocal... III.7. Extração de RNA total... III.8. Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)... III.9. PCR... III.10. Seqüenciamento... IV. RESULTADOS... IV.1. Deficiência de C1s... IV.2. Deficiência de C1s Combinada com a Deficiência de C1r... IV.3 Western Blotting.55 IV.4. Microscopia Confocal.57 IV.5. Expressão de RNAm de C1s em Células de Indivíduos Normais...60 IV.7. Seqüenciamento... IV.8. Produção de Diversos Trancritos de C1s...68 V. DISCUSSÃO...70 VI. CONCLUSÕES...80 VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS I. INTRODUÇÃO I.1. Lúpus Eritematoso Sistêmico O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune de etiologia desconhecida que afeta mais de um milhão de indivíduos a cada ano, mais freqüente em mulheres que homens. Na infância, a taxa de ocorrência no sexo feminino para o masculino é 3:1. Durante a puberdade, a taxa passa para 10:1 e depois da menopausa cai para 8:1 (LAHITA, 1999). Esta variação pode estar relacionada a diferenças na produção de certos hormônios como estrógenos, andrógenos, prolactina e hormônio liberador da gonadotrofina (YACOUB WASEF, 2004). A palavra lúpus que vem do latim e significa lobo foi utilizada pela primeira vez em 1817 para definir o que é conhecido hoje como lúpus vulgaris, um tipo de tuberculose. Só em 1947, que HARGRAVES et al. descobriram a célula de lúpus eritematoso (LE) e em seguida descobriu-se que o fenômeno da célula de LE era a reação de anticorpos do soro de pacientes que apresentavam LES com o núcleo (FRIOU, 1958) e nucleoproteínas (HOLMAN E KUNKEL, 1957). Com o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais avançados que possibilitassem a realização de estudos genético-moleculares, a busca pela causa e tratamento de LES gerou mais de publicações relacionadas com lúpus até o momento, em uma prevalência estimada entre 17 a 48/ pessoas no mundo (KURIEN E SCOFIELD, 2006). Atualmente acredita-se que o desenvolvimento da doença depende de fatores genéticos e ambientais, e a concordância de LES em gêmeos monozigóticos (24 % a 69 %) confirma a importância da herança genética na prevalência da doença (ARNETT E REVEILLE, 1992). As manifestações clínicas variam muito em cada caso, para tanto o Colégio Americano de Reumatologia estabeleceu critérios para o diagnóstico de lúpus listados no Quadro 1 (baseado em TAN et al., 1982 e HOCHBERG et al., 1997). O paciente deve ter pelo menos 4 dos 11 critérios para ser caracterizado como portador de lúpus completo. 1 Quadro 1 Critérios diagnósticos do LES de acordo com o Colégio Americano de Reumatologia. Critérios Eritema malar Eritema discóide Fotossensibilidade Úlceras orais/nasais Artrite Serosite Glomerulonefrite Distúrbios neurológicos Distúrbios hematológic
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