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EFEITOS do HERBICIDA TORDON 2,4-D 64/240 TRIETANOLAMINA BR em FILHOTES de MÃES CONTAMINADAS durante a GESTAÇÃO e LACTAÇÃO

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PENÉLOPE GIACOMITTI EFEITOS do HERBICIDA TORDON 2,4-D 64/240 TRIETANOLAMINA BR em FILHOTES de MÃES CONTAMINADAS durante a GESTAÇÃO e LACTAÇÃO Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Morfologia
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PENÉLOPE GIACOMITTI EFEITOS do HERBICIDA TORDON 2,4-D 64/240 TRIETANOLAMINA BR em FILHOTES de MÃES CONTAMINADAS durante a GESTAÇÃO e LACTAÇÃO Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Morfologia área de concentração em Biologia Celular, da Universidade Federal do Paraná, visando à obtenção do título de mestre em Ciências Morfológicas Curitiba Paraná 1995 i Orientadora: Profª Drª Maria Teresa Barros Schütz Co-orientadora: Profª Dirnei Seli F. Baroni ii À DEUS que em Seu infinito Amor me deu condições para desenvolver e terminar mais este trabalho. Aos meus pais, Joâni Giacomitti e Alba Ceccon Giacomitti (sem palavras). Aos meus irmãos : Cícero Ceccon Giacomitti Lúcia Ceccon Giacomitti Joâni Giacomitti Júnior e Vitor Hugo Giacomitti, pela paciência. Ao meu namorado :Leônidas Alves Rosa, com carinho, pela compreensão. À minha nonna : Gema Catarina Simioni Ceccon (sem palavras). iii iv Todas as figuras deste trabalho são, exceção feita a capa inicial, Clip-art windons 2008 permitida reprodução não comercializável AGRADECIMENTOS Agradeço a orientação precisa, a paciência e a presença amiga da Profª Drª Maria Teresa Barros Schütz, que tornou possível levar a bom termo este trabalho. A co-orientação da Profª Dirnei Seli F. Baroni, que soube com maestria diremir todas as dúvidas surgidas a partir da metodologia e do material histológico. Ao Prof. Romeu Afonso Schütz pelo apoio e amizade. A todos os professores e funcionários do Departamento de Fisiologia, de Farmacologia e do Biotério, que de algum modo auxiliaram, aliviando tarefas ou facilitando o acesso ao material necessário, e muito contribuíram para o término deste trabalho. Em especial, Prof. Cláudio da Cunha, pelo auxílio no uso do computador, Cândido José Thomaz Pereira, técnico responsável pelo Biotério do Setor de Ciências Biológicas, Terezinha de Jesus do Carmo Andrade (D. Teresa) e Armelinda Silvino dos Santos e todos/as os/as demais funcionárias/os do Biotério. À Profª Drª Orieta Silveira, professora do Departamento de Bioquímica pelos esclarecimentos. Todo a apoio e amizade do Prof. Dr. Waldemiro Gremski, professor de pós-graduação do Departamento de Biologia Celular. A Joâni Giacomitti Júnior, pelo empenho e capricho na elaboração final deste trabalho. Aos amigos e colegas da turma: Cecília, Luís, Hamilton, Ivone Maria, Ivone Cipriano, Sônia e todos os demais colegas, pelo carinho, incentivo e apoio. À Coordenação do Curso de Pós-Graduação, professores, funcionários e amigos do Departamento de Morfologia/Biologia Celular da Universidade Federal do Paraná, pelo incentivo e apoio. Em especial, Elinor, exsecretária do curso de pós-graduação, Rubens Gaier e auxiliar, técnicos em histologia, Ana Maria Brauza Cunha, funcionária, e Marlene Bonifácio, atual secretária do curso de pós-graduação. A todos aqueles que direta ou indiretamente tornaram possível a execução e término deste trabalho. Ao CNPq pela bolsa de mestrado e à PRPPG pelo apoio financeiro. v ÍNDICE PÁGINA AGRADECIMENTOS... V ORGANOGRAMAS E TABELAS... VIII GRÁFICOS E FIGURAS... X ABREVIATURAS... XII RESUMO... XIV ABSTRACT... XVI 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS MATERIAL E MÉTODOS Local de trabalho 3.2. Animais experimentais 3.3. Herbicida 3.4. Metodologia Acasalamento Nascimento dos Filhotes Peso Corporal Reflexo de Endireitamento Abertura Palpebral Sexagem Testes comportamentais Movimentação espontânea Teste do Rota-Rod Exposição ao Open-Field Teste do Plus Maze ou Labirinto em X Esquiva Ativa vi 3.5. Estatística Morfologia Coloração por H.E Nitratação Evidenciação da Bainha de Mielina 4. RESULTADOS Dias de Acasalamento e Gestação 4.2. Proporção Sexual Organogramas 4.3. Peso Corporal 4.4. Desenvolvimento pós-natal Reflexo de Endireitamento Abertura Palpebral 4.5. Testes Comportamentais aos 40 dias de idade Movimentação Espontânea Rota-Rod 4.6. Testes Comportamentais aos 90 dias de idade Movimentação Espontânea Rota-Rod Exposição ao Open-Field Teste do Plus-Maze ou Labirinto em X Esquiva Ativa Fêmeas que não se apresentaram prenhas Número de Filhotes mortos/devorados Outras Observações Morfologia Coloração com hematoxilina-eosina (H.E.) Nitratação Evidenciação da bainha de mielina 5. DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS vii LISTA DE ORGANOGRAMAS E TABELAS página Organograma 1. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 1 do grupo controle Organograma 2. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 2 do grupo controle Organograma 3. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 3 do grupo controle Organograma 4. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 1 do grupo Tordon Organograma 5. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 2 do grupo Tordon Organograma 6. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 3 do grupo Tordon Organograma 7. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 1 do grupo Tordon Organograma 8. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 2 do grupo Tordon Organograma 9. Representa o número de machos e fêmeas nascidos na geração F 3 do grupo Tordon Tabela 1. Descreve a análise estatística pelo método x 2, feita para avaliar a proporção sexual observada nos grupos experimentais (C, T, TT) Tabela 2. Apresenta os resultados obtidos em cada um dos parâmetros observados durante o teste no Open-Field Tabela 3. Representa as porcentagens da ocorrência, em cada geração, de fêmeas não prenhas ou com filhotes mortos e/ou devorados viii ix LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS página Gráfico 1. Representação do número de dias que os animais demoraram a nascer, a partir do primeiro dia de acasalamento dos pais Gráfico 2. Representação da proporção sexual observada durante as três gerações (F 1, F 2 e F 3 ) dos três grupos experimentais Gráfico 3. Representa a curva de peso corporal apresentada pelos filhotes dos grupos C e T, da primeira geração, do 1º ao 101º dia de vida Gráfico 4. Representa o número de dias que os filhotes dos dois grupos experimentais (C e T) demoraram a desenvolver o reflexo de endireitamento e para abrir completamente a fenda palpebral Gráfico 5. Representa a motricidade dos filhotes quando jovens (com 40 dias) e depois de adultos (com 90 dias), a partir do número de vezes que interrompem feixes fotoelétricos Gráfico 6. Representa o equilíbrio apresentado pelos filhotes, quando jovens (com 40 dias) e depois já adultos (90 dias), no teste do Rota-Rod Gráfico 7.1. Representa a motricidade espontânea e a completa imobilidade dos animais experimentais em resposta a situação de exposição ao Open-Field, por 5 minutos Gráfico 7.2. Representa o tempo de grooming, o número de rearing ocorridos e o número de bolos fecais excretados durante a exposição ao Open-Field, por 5 minutos Gráfico 8.1. Representa a porcentagem média do número de vezes que os animais experimentais entraram, espontaneamente, no braço aberto ou fechado durante o teste do Plus-Maze Gráfico 8.2. Representa a porcentagem média de tempo que os animais experimentais permaneceram em cada tipo de braço (aberto ou fechado) durante o teste do Plus-Maze Gráfico 8.3. Relaciona a proporção de tempo sobre o número de entradas em cada braço (aberto ou fechado), observados durante o teste do Plus-Maze x Gráfico 9. Representa os diferentes parâmetros observados durante o teste comportamental que mede aprendizagem através da esquiva em situação aversiva (esquiva ativa) Figura 1. Caixa de movimentação espontânea Figura 2. Aparelho do Rota-Rod Figura 3. Aparelho do Open-Field Figura 4. Piso do Open-Field Figura 5. Aparelho do Plus-Maze Figura 6. Caixa de esquiva ativa Figura 7. Epidídimo controle corado por H.E. (200x) Figura 8. Epidídimo controle corado por H.E. (400x) Figura 9. Testículo controle corado por H.E. (200x) Figura 10. Testículo controle corado por H.E. (400x) Figura 11. Epidídimo contaminado corado por H.E. (400x) Figura 12. Testículo contaminado corado por H.E. (400x) Figura 13. Cérebro controle corado por H.E. (200 e 400x) Figura 14. Cérebro contaminado corado por H.E. (400x) Figura 15. Nitratação de cérebro controle (400x) Figura 16. Nitratação de cérebro contaminado (400x) xi ABREVIATURAS AChE Acetilcolinesterase ATPase Adenosina tri-fosfatase 2,4-D Ácido diclorophenoxiacético 2,4-D éster éster do ácido diclorophenoxiacético 2,4,5-T Ácido 2,4,5-triclorophenoxiacético C Grupo controle Ca íon Cálcio 14 C Carbono radioativo com 14 neutrons 5-HTP hidroxitriptofano 5-HIAA Ácido 5- hidroxiindolacético 5-HT Serotonina CIP Cruzamento Inter-Provas DA Dopamina DL Metade da dose necessária para matar o animal DPC Situação esquiva de duas vias F Primeira geração F Segunda geração F Terceira geração GABA Ácido gama aminobutírico Hz Hertz ma mili-ampére Na íon sódio NE Norepinifrina NEA Número de Entradas no braço Aberto NEF Número de Entradas no braço Fechado P Geração parental ou pais P.A produto químico puro Para Análise PCPA p-clorofenilalanina xii RC Resposta de Cruzamento t Teste estatístico t de student T grupo 1 contaminado com Tordon TA Tempo de permanência no braço Aberto TBPS t-butilbiciclofosforotionato TF Tempo de permanência no braço Fechado T/NEA Tempo de permanência dividido pelo Número de Entradas no braço Aberto T/NEF Tempo de permanência dividido pelo Número de Entradas no braço Fechado TT Grupo 2 contaminado com Tordon S.N.C Sistema Nervoso Central X Teste estatístico Qui-Quadrado xiii RESUMO Ratos das gerações P, F 1, F 2, foram contaminados com uma solução do herbicida Tordon 0,1% na água de beber. O processo de contaminação pelo Tordon foi efetuado sobre os filhotes, através de suas mães, durante o período de gestação e amamentação. Nas três gerações foram quantificados: a proporção sexual em cada ninhada, número de dias para o nascimento dos filhotes, número de filhotes que morriam após o nascimento em cada ninhada e em cada grupo experimental. Na geração F 1 foram quantificados o reflexo de endireitamento, o tempo de abertura palpebral, e o peso corporal, bem como, foram feitos testes comportamentais (movimentação espontânea, teste do Rota-Rod, teste do Open-Field, teste do Plus-Maze e esquiva ativa). Após todos estes processos, foi feito um estudo histológico a nível de sistema nervoso central e de testículos. Nossos resultados mostraram que a proporção sexual entre os filhotes de mães contaminadas (1 macho : 1 fêmea) é diferente (p 0,05) da proporção observada entre os filhotes do grupo controle (6 machos : 5 fêmeas). As fêmeas contaminadas demoraram mais (p 0,05) para dar cria que as fêmeas do grupo controle. Os animais contaminados nasceram com uma tendência de peso corporal menor, que se manteve até, aproximadamente, os 49 dias de idade. Aos 53 dias de idade o peso corporal destes animais tornou-se maior que os dos controles, permanecendo assim até a idade adulta. O reflexo de endireitamento levou mais tempo para ser adquirido no grupo Tordon, enquanto que o tempo de abertura palpebral é igual nos dois grupos. Nos testes comportamentais, verificamos que a movimentação espontânea aos 40 e aos 90 dias de idade é maior no grupo Tordon, sendo que no grupo controle há um decréscimo e no grupo Tordon um aumento da movimentação espontânea dos 40 para os 90 dias de idade. Por outro lado, no teste do Rota-Rod não se observou diferença entre os grupos experimentais. No teste do Open-Field os animais contaminados ambularam menos, tiveram um tempo de freezing maior, um número de rearing-up menor xiv e um tempo de grooming maior. Em relação aos parâmetros de defecação e micção, não foram observadas diferenças. No teste de Plus-Maze, os parâmetros %TA e T/NEA foram maiores no grupo Tordon. No teste de esquiva ativa os animais Tordon mostraram tendência a um desempenho maior. Apesar de todos estes resultados, o material histológico corado com H.E e/ou impregnado por prata não apresentou nenhuma alteração morfológica, quer seja a nível de S.N.C. ou a nível de testículos. Assim, devido a todas as alterações comportamentais observadas, podemos inferir que o herbicida Tordon contamina os filhotes através da barreira placentária, hemato-encefáfica e mesmo através do leite na amamentação. Podendo, com isto, causar alterações funcionais irreversíveis no S.N.C. Alterações estas que foram observadas na idade adulta do animal, quando foram feitos os testes comportamentais e não havia contato com o herbicida há, pelo menos, 40 dias. xv ABSTRACT Three generation of rats P, F 1, F 2 was contaminated with Tordon 0,1% solution in water drink. The offspring Tordon contamination was done via their mothers during pregnancy and lactation. At the three generation was quantified the sexual ratio in each progeny; number of days for bird offspring and number of dead offspring in each experimental group. The F 1 was used for quantified the time to respond stand upright reflex; eyelid opening time; body weight and behavioral tests (spontaneous movement, Rota-Rod time, Open-Field test, Plus-Maze test and active avoidance) and histological studies of C.N.S and testicles. Our experimental results demonstrated a sexual ratio 1 male : 1 female at the contaminated animal (TA) and 6 males : 5 females in control group (CA); contaminated females had longer gestational period than the control females; the (TA) were born with non significant lower body weight in comparison the (CA). However from 53 days old their average body weight become higher than the mean of non contaminated group; the contaminated rats were able to responsed to the stand upright reflex later than (CA) in spite of eyelid opening time being the same for both groups. At behavioral tests we have found that : Tordon group spontaneous movement rate was higher than the (CA) at 40 and 90 days old with a increasing rate in (TA) and decreasing rate in (CA) between first and second measurement. The results from Rota-Rod test were similar to both groups. Contaminated animals at the Open-Fields test, ambulated less, had a higher time of freezing, lower number of rearing-up and a higher time of grooming. Number of boluses and miction equal to control group. Plus-Maze test showed higher TA% and T/NEA for (TA), while active-avoidance test demonstrated a tendency of worse of performance for (TA). In spite of morphological alteration of C.N.S. and testicles were not observed at histological examinations, the behavioral changes found led us to condud that probably Tordon herbicide was able to cross the placentary and hemato-encephalic barrier and were present at the milk, causing irreversible functional alterations at C.N.S. that stayed until adult age when the behavior test occurred. xvi xvii 1.INTRODUÇÃO Segundo as pesquisas da EMATER do Paraná, na região metropolitana de Curitiba, apenas 13% dos agricultores utilizam agrotóxicos seguindo as instruções; 75% não respeitam os períodos de carência; 91% não usam proteção quando fazem aplicação; 67% poluem rios e córregos e 24% reutilizam as embalagens para guardar ou transportar alimentos (Tararthuch, 1992). O Tordon é um agrotóxico organoclorado comumente usado em sítios e fazendas no norte do Paraná para combater ervas daninhas do pasto e impedir o crescimento de vegetais de folhas largas (dicotiledôneas). O Tordon nada mais é do que a associação de dois herbicidas : o 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético) e o picloram (ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolínico) e seus sais de potássio (C6H2Cl3KN2O2), que no entanto, recebem impurezas durante a produção, as chamadas dioxinas. Sua composição age exatamente como o Agente Laranja que por sua ação desfolhante foi utilizado, pelos norteamericanos, como arma química durante a guerra do Vietnã para descamuflar os soldados. Esta barbárie produziu inúmeras crianças, com má-formações congênitas, filhas de pais anteriormente expostos ao agrotóxico (Reis, 1991). O TORDON é composto pelo 2,4-D, pelo picloram e por resíduos chamados dioxinas. O 2,4-D é prontamente degradado por hidrólise não representando um risco de longo prazo ao meio. No entanto, o picloram é altamente persistente, com resíduos detectáveis no solo até três anos após a aplicação e mantém sua toxicidade por até cinco anos para certas cepas suceptíveis (Fao, 1964). A DL50 do 2,4-D ingerido na comida é de 666 mg/kg para ratos e foi descrita em 1947 por Hill e Carlisle. Os mesmos autores afirmam que a maior dose, sem efeitos indesejáveis, para macacos é de 214 mg/kg e, que existe perigo potencial para a saúde humana através da inalação ou ingestão de alimentos contaminados. Entretanto, Gorzinski et al. (1987), trabalhando num laboratório da DOW CHEMICAL COMPANY, observaram que doses de até 20 mg/kg na dieta de ratos machos e fêmeas não tiveram efeitos tóxicos observáveis. Goldstein et al.(1959) afirmam que este herbicida se for usado deverá sê-lo com grande cautela. Segundo o mesmo autor a DL50 oral do Tordon 22K (25% sal potássio do picloram) em ratos é estimada em mais que mg/kg, enquanto que do ácido picloram é de mg/kg (nível igual ao encontrado por McCollister & Leng, 1969). Defendendo-se do crescente mal estar criado pelos casos de contaminação e intoxicação humanas causados pelo Tordon, a empresa DOW CHEMICAL (que detém a marca registrada do herbicida) pediu revisão das informações toxicológicas sobre o produto e concluiu-se que a toxidade é baixa e não haverá risco algum se o produto for usado como recomendado no rótulo (Lynn, 1965). Erne (1966) verificou que, quando administrado oralmente, o composto é prontamente absorvido e distribuído pelo organismo. Os órgãos mais contaminados são o fígado, rim, pulmão e baço. Dados corroborados por Guzelian (1982) que descreveu a mesma ordem indicando níveis decrescentes de intoxicação e incluiu por último os músculos esqueléticos. No mesmo trabalho o autor observou que a difusão do 2,4-D no tecido adiposo e S.N.C. foi restrito, enquanto que ocorreu pronta transferência placentária em suínos e foram encontradas pequenas quantidades de 2,4-D nos ovos de galinhas. Estes resultados são concordantes com os de Bernard et al. (1985). Sabe-se que a maior parte do composto herbicida Tordon é excretada pelos rins por mecanismo aniônico orgânico que, segundo Berndt (1973), contribui com sua baixa toxicidade. No entanto, Tararthuch (1992) observou injúria no processo global de filtração e caracterizou o Tordon como agente nefrotóxico. Outrossim, Knopp & Shiller (1992) descreveram o aumento significante do volume de urina após administração oral de dois sais do 2,4-D. Knopp (1994) observou que os empregados que trabalhavam na produção e formulação do herbicida excretavam o 2,4-D na urina de maneira cumulativa, o qual só não era mais detectado após três semanas de interrupção da exposição. Os autores encontraram aumento das atividades do citocromo hepático p-450. Cipriano et al. (1991) verificaram que a ação do Tordon em macrófagos peritoniais intoxicados in vitro provoca intensa vacuolização. Por outro lado, Paulino & Palermo Neto (1991) verificaram que a intoxicação aguda pelo 2,4-D altera os níveis de algumas enzimas e componentes dos soro considerados indicadores de tecido injuriado, refletindo principalmente prejuízo hepático e muscular induzido pelo herbicida. Opistótonos (contração tetânica em arco) podem aparecer momentaneamente em animais intoxicados com 2,4-D, através de uma injeção subcutânea de 150 a 200 mg/kg, e membros posteriores são comumente mais nocivamente afetados do que membros anteriores (Bucher, 1946). 2 Goldstein et al. (1959) observaram que apenas algumas horas após o manuseio do 2,4-D para matar ervas daninhas, três pessoas (dois homens com 52 e 65 anos de idade e uma mulher com 50 anos) foram hospitalizadas com sintomas progressivos de dor, parestesias e paralisias graves. Têm-se poucas dúvidas de que a contaminação não tenha ocorrido por absorção dérmica do produto. A prostração foi grande e a recuperação incompleta mesmo após anos. O diagnóstico de neuropatia periférica foi suportado por exame eletromiográfico. Pelletier
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