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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica GERSON ROBERTO LUQUETA

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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica GERSON ROBERTO LUQUETA AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR OZÔNIO EM MEMBRANAS
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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica GERSON ROBERTO LUQUETA AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR OZÔNIO EM MEMBRANAS DE ÁCIDO POLI (LÁTICO-CO-GLICÓLICO) São José dos Campos, SP 2016 GERSON ROBERTO LUQUETA AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR OZÔNIO EM MEMBRANAS DE ÁCIDO POLI (LÁTICO-CO-GLICÓLICO) Tese de Doutorado apresentada no Programa de Pós- Graduação em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos para obtenção do título de Doutor em Engenharia Biomédica. Orientador: Prof o. Dr. Homero Santiago Maciel Co-orientador: Prof o. Dr. Rodrigo Sávio Pessoa São José dos Campos, SP 2016 Ficha Catalográfica Folha de aprovação Dedico este trabalho à minha esposa Marli e a meus filhos Thiago e Matheus pelo incentivo e, sobretudo, pela paciência durante os longos períodos em que os deixei de lado para me concentrar na pesquisa. AGRADECIMENTOS A Deus acima de tudo, pela vida e suas oportunidades. A meus orientadores Prof. Dr. Homero Santiago Maciel e Prof. Dr. Rodrigo Sávio Pessoa pelos ensinamentos, dedicação, paciência e carinho com que me ajudaram nesta empreitada. Ao professor Dr. Roberto Hübler - Coordenador do GEPSI-LMN, Coordenador do Grupo de Nanobiotecnologia da PUC-RS, por disponibilizar seu tempo, conhecimento, laboratórios e equipe para apoiar a minha pesquisa. À empresa Baumer S.A na pessoa da Diretora de Pesquisa em Desenvolvimento Dra. Lourdes Maria Araújo Quaresma de Camargo pelo apoio técnico e recursos materiais, sem os quais a pesquisa não seria possível. Ao meu colega de doutoramento Everton Diniz dos Santos pela importante contribuição à pesquisa. Aos professores do IP&D pela inestimável contribuição ao meu aprendizado e crescimento científico. Aos colegas de turma que ajudaram a tornar a caminhada mais prazerosa. À minha família que sempre me apoiou e me incentivou.. O acaso só favorece os espíritos preparados e não prescinde da observação. Louis Pasteur ( ) AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE ESTERILIZAÇÃO POR OZÔNIO EM MEMBRANAS DE ÁCIDO POLI (LÁTICO-CO-GLICÓLICO) RESUMO O ácido Poli (Lático-co-Glicólico) é um copolímero que constitui a base de muitas estruturas passíveis de utilização na regeneração de tecidos biológicos tais como pele, ossos e cartilagens graças à sua característica de biocompatibilidade e biorreabsorção. Como são elementos implantáveis, estes devem ser esterilizados antes da utilização. A esterilização destes elementos constitui uma fase delicada do processo de industrialização, pois, dadas as características do copolímero, os meios tradicionais utilizados são incompatíveis, degradam o material ou agregam contaminantes indesejáveis. No tocante ao tema, vários processos de esterilização já foram estudados, como os processos térmicos (vapor e calor seco), radiação, óxido de etileno, peróxido de hidrogênio, dentre outros. Nesta pesquisa decidiu-se avaliar o efeito do método de esterilização por ozônio em membranas de copolímero de ácido poli (lático-co-glicólico), uma vez que são escassos os trabalhos que relacionam diretamente o gás a este tipo de material. Para chegar-se ao resultado do estudo foi necessário o desenvolvido do método como um todo, desde a concepção do equipamento para o processo de esterilização, passando pela avaliação das embalagens compatíveis até, finalmente, chegar-se ao cerne da pesquisa. Os resultados apontaram para uma redução de massa molar na ordem de 35%, o que situa o processo entre o óxido de etileno e a irradiação gama. Por outro lado, não foram observadas alterações morfológicas na membrana e nem alterações químicas na superfície, sugerindo que o processo pode ser utilizado como alternativa viável para a esterilização do copolímero estudado, principalmente se forem considerados os custos operacionais em relação a outros sistemas. Palavras-chave: PLGA. Ozônio. Esterilização. Dispositivos médicos. Embalagens. ASSESSMENT OF OZONE STERILIZATION PROCESS IN MEMBRANES OF POLY(LACTIC-CO-GLICOLIC) ACID ABSTRACT Poly (lactic-co-glycolic) acid is a copolymer that forms the basis of many structures suitable for use in the regeneration of biological tissues such as skin, bone and cartilage due to the biocompatibility and bioabsorbable characteristic. Like others implantable devices, the copolymer must be sterilized before use. Sterilization of these elements is a delicate phase of the industrialization process because, given the characteristics of the copolymer, the traditional means used could be incompatible, degrade the material or add undesirable contaminants. On the topic, various research on sterilization processes such as thermal processes (steam and dry heat), radiation, ethylene oxide, hydrogen peroxide and others were studied. In this study was decided evaluate the effect of ozone sterilization method on the membranes of poly (lactic-co-glycolic acid), because studies about this theme are scarce. To get the results was necessary develop a full solution, from the design of equipment for the sterilization process, passing by evaluation of compatible packages to, finally, get to the research core. The results pointed to a molecular weight reduction of around 35%, which places the process between ethylene oxide and gamma irradiation. Moreover, there were no morphological changes in the membrane and or chemical changes on the surface, suggesting that the process can be used as a viable alternative for sterilization of the studied copolymer, especially if operating costs are considered in relation to other systems. Keywords: PLGA copolymer. Ozone. Sterilization. Medical device. Packaging material. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Mecanismos de ação para agentes esterilizantes Figura 2 - Estrutura atômica do ozônio Figura 3 - Ilustração do comportamento da barreira dielétrica na geração de ozônio.27 Figura 4 - Indicadores biológicos comerciais Figura 5 - Componentes de um IB autocontido Figura 6 - Caixa reutilizável para embalagem de instrumentais cirúrgicos Figura 7 - Embalagem descartável de papel-plástico Figura 8 - Estrutura e síntese do PLGA Figura 9 Aplicação clínica de membrana de PLGA em RTG Figura 10 Sequência para o desenvolvimento da pesquisa que caracteriza os efeitos do gás ozônio em membranas de PLGA Figura 11 - Fluxo de atividades para o desenvolvimento da pesquisa baseado na cronologia necessária para obtenção dos resultados Figura 12 - Estrutura fundamental do esterilizador por ozônio e seus componentes.47 Figura 13 - Célula geradora de ozônio Figura 14 - diagrama de conexões da interface eletrônica do gerador de ozônio Figura 15 - Foto do sistema de esterilização montado na bancada Figura 16 - Fluxograma principal de operação do esterilizador por ozônio Figura 17 - Reprodução da tela de programação do Portal TIA da Siemens utilizado para desenvolver o software do esterilizador por ozônio Figura 18 - Ambiente de programação DOPSoft com a tela de operação sendo editada Figura 19 - Tela principal do controlador dividida em suas áreas específicas Figura 20 - Diagrama de blocos do sistema monitorado pela RSSF Figura 21 - Foto do Radiuino e seus principais componentes Figura 22 - Perfil de ciclo utilizado para determinação dos tempos de processo Figura 23 - Fluxo de penetração do agente esterilizante no desafio microbiológico. 60 Figura 24 - Indicadores biológicos autocontidos de Geobacillus stearothermophilus.61 Figura 25 - Indicadores biológicos incubados a 57ºC Figura 26 Embalagens de uso único utilizadas para avaliação da compatibilidade com o ozônio Figura 27 Espectrofotômetro PerkinElmer SPOTLIGTH 400 do laboratório do IP&D da UNIVAP Figura 28 - Ensaio de tração da embalagem de papel grau médico Figura 29 - Membrana de PLGA alvo do ensaio Figura 30 - Membrana sendo pesada na balança analítica para determinação da massa total Figura 31 - Exemplo de curva gaussiana apresentando os diferentes tipos de massa molecular média de um polímero mono-modal, considerando uma distribuição simétrica Figura 32 - Processo de preparação e ensaio em microscopia eletrônica de varredura das membranas de PLGA Figura 33 - Perfil do ciclo de esterilização em termo de concentração do ozônio Figura 34 - Gráfico de caixa da concentração e temperatura na fase de patamar para o ciclo de ozônio Figura 35 - Resultados da análise visual e táctil das embalagens de uso único Figura 36 Espectro FTIR da bolsa de papel-plástico (lado do papel) no material esterilizado com valores picos identificados Figura 37 - Os espectros de FTIR do SMS não esterilizado Figura 38 - Os espectros de FTIR do SMS esterilizado Figura 39 Espectro FTIR de papel crepado não esterilizado Figura 40 - Os espectros de FTIR da bolsa Tyvec-plástico (lado do Tyvec) esterilizado Figura 41 - Microscopia da superfície do papel grau médico antes da exposição ao ozônio Figura 42 - Microscopia da superfície do papel grau médico depois da exposição ao ozônio Figura 43 - Resultado do cálculo da perda de massa total das membranas após o processo de esterilização, ao longo de 8 semanas. n= Figura 44 - Gráfico FTIR das membranas de PLGA esterilizada e não esterilizada. 90 Figura 45 - Microscopia Eletrônica de Varredura das membranas de PLGA não esterilizada (referência) Figura 46 - Microscopia Eletrônica de Varredura das membranas de PLGA esterilizada por ozônio LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Propriedades físicas do ozônio Tabela 2 - Valores médio, mediana e desvio padrão da concentração e da temperatura durante os patamares no ciclo de esterilização por ozônio Tabela 3 - Resultado dos ensaios com indicadores biológicos autocontidos contendo Geobacillus stearotermophillus com população inicial de 10 6 UFC Tabela 4 - Resultados do teste de tração na embalagem de papel grau médico com as porções plástico e papel analisados individualmente Tabela 5 - Valores da massa molar das membranas de PLGA ao longo de oito semanas Tabela 6 - Picos identificados na análise por FTIR das membranas antes e depois da exposição ao ciclo de ozônio, relacionando o modo vibracional Tabela 7 - Comparativo dos resultados do método de esterilização por ozônio com o artigo de referência LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ADN - Ácido desoxirribonucleico BIER - Biological Indicator Evaluation Resistometer CLP - Controlador Lógico Programável CPU - Unidade Central de Processamento DBD - Descarga em Barreira Dielétrica ETO - Óxido de Etileno FDA - Food and Drug Administration FTIR - Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier GPC - Cromatografia de Permeação em Gel H 2 O 2 Peróxido de hidrogênio IB - Indicador Biológico IDE - Integrated Development Environment IHM - Interface Homem-Máquina LTSF - Mistura Vapor e Formaldeído a Baixa Temperatura MEV - Microscópio Eletrônico de Varredura O 2 - Oxigênio O 3 - Ozônio PDS - Polidioxanona PE - Polietileno PET - Politereftalato de Etileno PGA Polyglycolic Acid PLA - Polylactic Acid PLGA - Poly(lactic-co-glycolic) acid ppm - parte por milhão RSSF Rede de Sensores Sem Fio RTG - Regeneração Tecidual Guiada SAL - Sterility Assurance level SMS - Spunbond-Meltblown-Spunbond SPI - Serial Peripheral Interface Tg - Temperatura de Transição Vítrea TIA - Totally Integrated Automation TNT Tecido-não-tecido SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS Motivação Objetivo geral Objetivos específicos Organização do trabalho REVISÃO DA LITERATURA Princípios de esterilização O ozônio Geração Aplicação como agente esterilizante Variáveis críticas na esterilização por ozônio Indicadores biológicos para esterilização Embalagens para dispositivos médicos Biomateriais poliméricos sintéticos Tipos e aplicações O copolímero PLGA Esterilização do PLGA MATERIAIS E MÉTODOS Planejamento do processo Esterilizador por ozônio Esterilizador e seus componentes Automação do processo e testes funcionais A rede de sensores sem fio Parametrização do processo de esterilização Procedimento para determinação do tempo de exposição Avaliação das embalagens de uso único Procedimento para ensaio das embalagens Esterilização das membranas de PLGA Preparação das membranas e esterilização Determinação da massa total Determinação da massa molar por GPC Análise química por FTIR Análise morfológica por MEV RESULTADOS Resultados do esterilizador por ozônio Perfil do ciclo Determinação do tempo de esterilização Embalagens de uso único... 79 5.2.1 Resultado da análise visual a táctil Resultado da análise por FTIR Resultado do ensaio de tração Resultado da microscopia sobre o papel Efeito do ozônio sobre a membrana de PLGA Resultado da verificação da massa total Resultado da verificação da massa molar Resultado do FTIR Resultado do MEV DISCUSSÃO CONCLUSÃO Trabalhos futuros REFERÊNCIAS ANEXO A - RESULTADOS DA CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL AO LONGO DE OITO SEMANAS 16 1 INTRODUÇÃO Polímeros biorreabsorvíveis compõe uma gama de materiais utilizados na área médica em substituição aos materiais tradicionais metálicos e não metálicos na reconstrução guiada de tecidos (HUTMACHER; HÜRZELER; SCHLIEPHAKE, 1996). Estes polímeros podem ser utilizados no desenvolvimento de suturas, proteções da pele, fixadores ortopédicos, implantes odontológicos, clipes para ligamentos, como agentes de liberação controlada de drogas, entre outros (BERNKOPF, 2007; MIDDLETON; TIPTON, 2000). Basicamente um polímero biorreabsorvível é um material de origem natural ou sintética, degradável, e suas propriedades dependem de sua composição, estrutura e do arranjo de suas macromoléculas. Os polímeros naturais podem ser classificados como proteínas, polissacarídeos ou polinucleotídios enquanto os sintéticos são aqueles obtidos por meio de processos produtivos controlados (DHANDAYUTHAPANI et al., 2011). Os polímeros mais comuns utilizados em reconstrução tecidual são os que empregam o poliéster alifático (da família polihidroácido), sendo os mais simples o poli(ácido glicólico) (PGA) e o poli(ácido lácteo) (PLA) (HUTMACHER; HÜRZELER; SCHLIEPHAKE, 1996). Da síntese combinada dos ácidos também se originam os copolímeros que são amplamente estudados e aplicados na medicina. Dentre a gama de copolímeros possíveis está o ácido Poli(Lático-co-Glicólico) (PLGA do inglês Poly(Lactic-co-Glycolic) Acid) que é um copolímero biorreabsorvível, não tóxico, biocompatível, de cinética de degradação relativamente ajustável em função da razão entre seus monômeros (DHANDAYUTHAPANI et al., 2011) com grande viés técnico e comercial, já que seu uso como biomaterial para entrega de medicação controlada e para recuperação tecidual é aprovado por órgãos regulamentadores, como o U. S. Food and Drug Administration (FDA) (LU et al., 2009; MAKADIA; SIEGEL, 2011). O PLGA, assim como outros implantáveis, pode ser produzido em diversos formatos, dependendo da sua aplicação, tais como estruturas tridimensionais, fios e membranas. Por tratar-se de um implantável, um dos procedimentos pelo qual o material deve ser submetido antes de sua aplicação final é o que envolve um método de esterilização, que tem por objetivo prevenir a ocorrência de processo 17 infeccioso no paciente, causado por microrganismos viáveis presentes no material (MATTHEWS; GIBSON.; SAMUEL, 1994). Existe uma considerável gama de métodos de esterilização de materiais, os quais podem envolver processos físicos, químicos ou uma combinação de ambos. Dentre os métodos padrão estão o vapor saturado, calor seco, Óxido de Etileno (ETO), Plasma de Peróxido de Hidrogênio, Imersão líquida (ácido paracético ou glutaraldeído), radiações ionizantes, mistura vapor e formaldeído a baixa temperatura (LTSF), Ozônio (O 3 ) e gás de Peróxido de Hidrogênio vaporizado (KILLEEN; MCCOURT, 2012; RUTALA; WEBER, 2008), sendo os métodos de esterilização por ozônio e por H 2 O 2 vaporizado as tecnologias mais recentes (ACKERT-BURR, 2010). Polímeros e copolímeros, como o PLGA, não podem ser esterilizados nos métodos que utilizam calor seco (estufas) ou calor úmido (autoclaves a vapor) dada sua degradabilidade na presença de umidade e sua temperatura de transição vítrea reduzida (Tg) (PAN; DING, 2012), restringindo a possibilidade de processos aplicáveis aos chamados métodos a baixa temperatura, que são os que, excluindose a radiação ionizante, empregam como agente esterilizante algum elemento químico tal como o ETO, H 2 O 2, formaldeído, glutaraldeído, O 3, etc. (RUTALA; WEBER, 2013). Trabalhos voltados à esterilização de copolímeros biorreabsorvíveis apontam que os métodos conhecidos causam sempre algum tipo de alteração no produto, sendo as mais relevantes a presença de resíduos tóxicos, alterações morfológicas, perda de massa molar ou aceleração indesejável da degradação, independentemente da eficácia microbiana (ATHANASIOU; NIEDERAUER; AGRAWAL, 1996; HOLY et al., 2001). Tais alterações no produto final podem aumentar a complexidade ou o custo produtivo do copolímero que, por sua vez, pode tornar o produto menos acessível, principalmente na rede pública de saúde. Desenvolver e testar métodos validáveis de esterilização que possam garantir a esterilidade do copolímero e ao mesmo tempo minimizar os impactos do processo nas características física e química do material é um desafio que invoca a pesquisa científica. Neste quesito, o gás ozônio pode ser um agente de boa aplicabilidade, dada sua comprovada eficácia microbiológica em temperatura ambiente (MAHFOUDH, A. et al., 2010) e sua boa compatibilidade com uma série de materiais poliméricos (LEROUGE; SIMMONS, 2012, p. 176). 18 O ozônio é um gás oxidante, com odor característico, de aspecto incolor a baixas concentrações (até 0,04ppm) e de aspecto azulado em altas concentrações (15 a 20%) (BATAKLIEV et al., 2014) e pode ser obtido por eletrólise, descarga elétrica, radiação ultravioleta ou aplicação radioquímica (SOMALWAR; JANEKAR; UMATE, 2014) sendo a geração do ozônio por descarga elétrica em barreira dielétrica (DBD) o método mais comum utilizado em processos práticos e experimentais (KOGELSCHATZ, 2003). No dispositivo DBD, em sua configuração básica, dois eletrodos metálicos encontram-se distanciados entre si e pelo menos um deles está recoberto por um isolante (dielétrico). Os eletrodos são submetidos a uma diferença de potencial por meio de uma fonte de corrente alternada ou pulsante de modo a formar descargas ou microdescargas no espaço entre eles, mas sem que haja formação de arco voltaico de ruptura (KOGELSCHATZ; ELIASSON; EGLI, 1997). Pelo espaço entre os eletrodos faz-se passar ar ou oxigênio. Se o oxigênio for utilizado como fonte gasosa, os elétrons de alta energia da descarga dissociam moléculas de oxigênio em átomos que colidem com outras moléculas de oxigênio, formando moléculas de ozônio (SAMARANAYAKE et al., 2000). Este gás, de alto poder oxidante, pode então ser aplicado ao material a ser esterilizado. 19 2 OBJETIVOS Nesta seção justifica-se a motivação da pesquisa, as metas tanto no cômpito geral quanto específico e a forma organizacional dos trabalhos. 2.1 Motivação Estudar, desenvolver e validar processos de esterilização que possam garantir o nível de esterilidade de implantes a base do copolímero de ácido poli(lático-co-glicólico) com a menor perda de massa molar, menor impacto na morfologia e menor taxa de resíduos tóxicos em sua superfície é fator crucial para o desenvolvimento de produtos acessíveis técnica e comercialmente, uma vez que a redução da massa e as alterações indesejáveis das características mecânicas do copolímero afetam diretamente o custo produtivo e, consequentemente, tornam o acesso à tecnologia mais seletivo. 2.2 Objetivo geral Avaliar os efeitos do método de esterilização por ozônio em membranas de ácido Poli (Lático-co-Glicólico). 2.3 Objetivos específicos a) Desenvolver um sistema de esterilização por ozônio configurável em suas variáveis significativas de processo; b) Verificar a eficácia do sistema de esterilização frente a um microrganismo padrão; 20 c) Avaliar o tipo de embalagem industrial flexível e descartável mais adequada para o processamento por ozônio; d) Aplicar
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