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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ RODRIGO FAITTA CHITOLINA. PROTEÔMICA DA GLÂNDULA SALIVAR DE Aedes (Stegomyia) aegypti INFECTADO COM DENV-2 e 3

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ RODRIGO FAITTA CHITOLINA PROTEÔMICA DA GLÂNDULA SALIVAR DE Aedes (Stegomyia) aegypti INFECTADO COM DENV-2 e 3 CURITIBA 2015 RODRIGO FAITTA CHITOLINA PROTEÔMICA DA GLÂNDULA
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ RODRIGO FAITTA CHITOLINA PROTEÔMICA DA GLÂNDULA SALIVAR DE Aedes (Stegomyia) aegypti INFECTADO COM DENV-2 e 3 CURITIBA 2015 RODRIGO FAITTA CHITOLINA PROTEÔMICA DA GLÂNDULA SALIVAR DE Aedes (Stegomyia) aegypti INFECTADO COM DENV-2 e 3 Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Microbiologia, Parasitologia e Patologia, da Universidade Federal do Paraná. Orientadora: Dra. Magda Clara Vieira Costa- Ribeiro Co-orientadora: Dra. Márcia Gonçalves de Castro CURITIBA 2015 Dedico esse trabalho a meus pais Adair e Vera, meus irmãos Henrique e Arthur e ao meu companheiro Syllas. Obrigado pelo apoio, carinho, amor, compreensão e dedicação. 3 AGRADECIMENTOS Uma jornada só é possível quando os quatro pilares que regem nossa vida estão em harmonia e fortes para superar qualquer vendaval, sendo assim devo agradecer a esses quatro pilares: Fé, Amor, Amizade e Ensinamentos. Agradeço a Deus por me ensinar a ter Fé e pelas alegrias, conquistas e bons momentos que experimentei ao longo da minha vida, mas também pelos momentos de dificuldade que tanto me ajudaram a crescer. Agradeço a minha família, a forma mais pura do Amor, por nunca me deixarem só. Aos meus pais, Adair André Chitolina e Vera Inês Faitta, que estiveram sempre presentes e me apoiando nos mais diferentes aspectos da minha vida, e que mesmo após estes 6 anos em que não nos vemos diariamente, o amor e o carinho estão sempre representados nos mais singelos atos. Aos meus irmãos Henrique e Arthur, que mesmo com brigas e discussões fraternais são parte importantíssima da minha vida. Ao meu companheiro Syllas, por me ajudar nas batalhas diárias antes e todas as demais que enfrentaremos juntos daqui para frente. À Ana, Marcelo, Silvio, Dilma, Livia, Isis e Gabriel minha segunda família que me acolheram. E a todas as outras pessoas da minha família que de uma maneira ou outra me ajudam e me apoiam. Amo vocês! Agradeço a Amizade dos amigos, cuja vitalidade e alegria de viver me encorajaram sempre a persistir e rir, não importando a situação. Agradeço aqueles que estavam perto de corpo, aos que estavam perto de alma, aos que me auxiliaram em diversos aspectos nessa caminhada do mestrado. Obrigado Suelin, Germano, Carla, Ana Caroline, César (papis), Vinicius Richard, Débora, Maiara, Oscar, Filipe, Thais, Isabela (Japinha), Andressa, Letícia, Jason, Fábio (Padre), Graci, Luciana, Julio, Juan, Carlos, Jeff, Anielly, Rosilainy, Mauro, Keli, Inês, Cristiane, Taissa, Estér, Ademir, Bruno, Rodrigo Chaves, Rodrigo Demeterco, Kiko, Everson, Rodrigo Barth, Wellington, Vinicius Chagas, Gonzalo, Marceli, Francielli, Aline, Bruno, Mariana Santos, Mariana Toledo, Emerson, Marise, Rodrigo Neves, Tatiane, Leonardo, Neto, Mano, Sil. Obrigado a todos seja pela conversa, por compartilhar sua casa nas viagens, pelas alegrias e também broncas. Por último, um obrigado mais do que especial a essa nova amizade que iniciou no mestrado e só tende a perdurar, obrigado a você Izanara, pelos inúmeros momentos que passamos ao longo desses dois anos. A amizade de todos vocês tornou isso possível! Agradeço aos Ensinamentos dos mestres e colegas que permitiram que não apenas esse trabalho fosse possível como também o meu crescimento profissional. Obrigado a família Lathema, por me acolherem e passarem seus ensinamentos, Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira, Dra. Teresa Fernandes, Dra. Nildimar Honório, Dra. Maria Goreti Rosa Freitas, Msc. Dinair Couto, Dr. Rafael Maciel de Freitas, Dra. Monique Albuquerque e em especial a minha coorientadora Dra. Márcia Gonçalves de Castro pelo auxílio e disponibilidade em tornar esse trabalho possível. Obrigado aqueles que auxiliaram na tarefa de desvendar o mundo das proteínas a Msc. Alessandra Becker, Dr. Luiz Rizzo, Msc. Graciele, Dr. Michel Batista, Dr.Fabricio Marchini, Dra. Juliana Moura, Dra. Larissa Alvarenga e ao professor Dr. Ciro Alberto de Oliveira. Cabe ainda um agradecimento a professora Dra. Débora do Rocio Klisiowicz por ter sido a pessoa que não apenas permitiu o início dessa jornada, como também me resgatou em um momento tão difícil. Por fim, mas não menos importante e sim com muito apreço e estima a minha orientadora professora Drª Magda Clara Vieira da Costa-Ribeiro. Agradeço não só os momentos de ensinamentos, mas também por ter me ajudando a abrir portas e pelos momentos de debate e discussão, mesmo que isso tenha feito essa jornada do mestrado uma verdadeira montanha-russa de ensinamentos, discussões e aprendizados. Muito obrigado principalmente por me permitir crescer e ascender profissionalmente. Muito obrigado a cada um de vocês mencionados aqui ou não, devido a falha humana de esquecimento, por terem sido parte fundamental nessa caminhada. Ainda, meu muito obrigado ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica da Universidade Federal do Paraná, à FIOCRUZ-RJ e ao Instituto Carlos Chagas FIOCRUZ-PR pelas colaborações e à CAPES pela concessão da bolsa. I don t stop when I m tired. I only stop when I m done Marilyn Monroe RESUMO O mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti é o principal vetor de importantes arboviroses, dentre elas a dengue, que acomete aproximadamente 390 milhões de pessoas por ano. Dentro da dinâmica da doença envolvendo a tríade mosquito- vírus-humano, estudos têm procurado explicar a relação existente entre o vírus e o vetor a fim de esclarecer os fatores associados à disseminação dos sorotipos virais, e as suas implicações na epidemiologia da doença. Ainda, no que concerne a transmissão do vírus, as glândulas salivares de Ae. aegypti é um órgão chave na disseminação viral, revestindo-se de grande interesse nos estudos de proteômica. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de proteínas da glândula salivar de fêmeas de Ae. aegypti infectadas com DENV-2 e 3 por meio da proteômica. Fêmeas de Ae. aegypti da cepa Paea foram submetidas ao repasto sanguíneo segundo três grupos de infecção: i) DENV-2, ii) DENV-3, iii) controle. Após 15 dias do repasto sanguíneo procedeu-se a extração da glândula salivar para realização das análises de proteômica, e a separação do corpo das fêmeas para detecção viral por meio da técnica de RT-PCR seguida da nested-pcr. Para as análises de proteômica, pools das glândulas salivares foram analisados por espectrometria de massa, associada à cromatografia líquida, com posterior análises nos programas MaxQuant e Perseus. O percentual de infecção das glândulas salivares utlizadas foi verificado a partir dos dados advindos da RT-PCR seguida da nested-pcr. Os grupos de infecção foram comparados dois a dois usando um Two samples test, através do teste-t. O percentual de infecção encontrado foi de 35% para os grupos de infecção (i) e de 45% para o grupo (ii). Após análise de todos os grupos glândulas salivares (i, ii e iii), obteve-se um total de 1588 proteínas identificadas. Pelo teste-t segundo p-valor (p 0,01) verificouse a expressão de 233 proteínas, ao passo que após teste de Benjamini-Hochberg este número reduziu para 85 proteínas diferencialmente expressas. Após as comparações, 85 proteínas apresentaram nível de expressão diferenciada sendo que dessas, 20 já foram descritas em estudos prévios. Foram identificadas proteínas do metabolismo celular, de funções digestivas, de repasto sanguíneo e da resposta imune do vetor. As proteínas foram classificadas segundo cinco categorias funcionais, sendo que aproximadamente 51% foram classificadas como proteínas do metabolismo básico. Ainda, 35% das proteínas encontradas não foram correlacionadas a nenhuma função. A análise de proteômica da glândula salivar permitiu a identificação de proteínas já descritas na literatura, bem como o encontro de novas proteínas que servirão de base para futuros estudos quanto a sua funcionalidade. Palavras-chave: Aedes (Stegomyia) aegypti. DENV. Biologia molecular. Proteômica. Glândula salivar ABSTRACT The Aedes (Stegomyia) aegypti mosquito is the main vector of important arboviruses, among them dengue fever, which affects approximately 390 million people per year. Within the dynamics of disease involving the mosquito-virus-human triad studies have tried to explain the relationship between the virus and the vector in order to clarify the factors associated with the spread of the serotypes, and their implications for the epidemiology of the disease. Also, regarding the transmission of the virus, the salivary gland of Ae. aegypti is a key organ in the viral spread becoming of great interest in proteomics studies. The objective of this study was to evaluate the expression of proteins of the salivary gland of Ae. aegypti infected with DENV-2 and 3 by means of proteomics. Ae. aegypti females, Paea strain, were blood feed according to three groups: i) DENV-2, ii) DENV-3, iii) control. After 15 days p.i. the salivary glands were extracted to proteomic analysis, and the body of the females were separated to perform virus detection by RT-PCR followed by a nested PCR. For proteomics analysis, pools of salivary glands were analyzed by mass spectrometry associated with liquid chromatography with subsequent analysis in MaxQuant and Perseus programs. The percentage of infection of the salivary glands used was found from the data arising from RT-PCR followed by nested-pcr. The infected groups were compared using a Two samples test. The percentage of infection was found to be 35% for the group of infection (i) and 45% for the group (ii). Following analysis of all salivary glands groups (i, ii and iii), there was obtained a total of 1588 identified proteins. According to the t- test using a p-value (p 0.01) as default it was possible to detect the expression of 233 proteins, whereas after Benjamini-Hochberg test this number dropped to 85 differentially expressed proteins. After comparisons annotation of the 85 proteins that showed differential expression level was carried out. Twenty of these proteins that were identified here had already been described in previous studies of infected salivary glands. It was possible to identify oroteins related to the cell metabolism, digestive functions, from blood meal and vector immune response. Proteins were sorted by five functional categories, of which approximately 51% were classified as the basic metabolism proteins. Furthermore, 35% of the proteins that were detected had not being correlated with any function (unknow function). The proteomic analysis of salivary gland allowed the identification of proteins described in the literature, as well as the discovery of new proteins that form the basis for future studies regarding to its functionality. Keywords: Aedes (Stegomyia) aegypti. DENV. Molecular biology. Proteomics. Salivary gland LISTA DE FIGURAS Figura 01 Distribuição das classes funcionais de proteínas identificadas no conjunto total avaliado e nos três diferentes grupos de comparação... 39 LISTA DE TABELAS Tabela I Tabela II Tabela III Tabela IV Tabela V Tabela VI Oligonucleotídeos utilizados nas reações de amplificação do vírus dengue e seus respectivos sorotipos, segundo Lanciotti et al. (1992) Número de fêmeas de Ae. aegypti (Cepa Paea) submetidas à infecção artificial pelos sorotipos virais DENV-2 ou DENV Número de glândulas salivares dissecadas e número de indivíduos selecionados para RT-PCR, conforme grupo de infecção Número de fêmeas de Ae. aegypti (Cepa Paea) positivas para infecção artificial, por meio da transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase Fêmeas de Ae. aegypti (Cepa Paea) infectadas por DENV nos pools de glândulas salivares utilizados para as análises de proteômica Determinação do número de proteínas exclusivas em cada grupo de infecção conforme análise pelo Diagrama de Venn Tabela VII Número de proteínas com expressão diferenciada entre os grupos de infecção, após teste-t com p-valor Tabela VIII Número de proteínas com expressão diferenciada entre os grupos de infecção, após teste de Benjamini-Hochberg Tabela IX Proteínas repetidas entre os agrupamentos de comparação estatistica segundo as análises do teste-t de Benjamini- Hochberg... 38 LISTA DE ANEXOS Anexo I Anexo II Anexo III Proteínas com expressão diferenciada no Grupo A (Controle DENV-2) após análise estatística segundo teste-t de Hochberg Proteinas com expressão diferenciada no Grupo B DENV-3) após análise estatística segundo teste-t de Hochberg Proteínas com expressão diferenciada entre no Grupo C (DENV- DENV-3) após análise estatística segundo teste-t de Hochberg... 65 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ACN Acetonitrila Ae Aedes ATP Adenosina trifosfato BOD Câmara de Germinação do tipo B.O.D. CID: Collisionally induced dissociation DDA Data Dependent Analysis DENV Dengue vírus DENV-1 Dengue vírus sorotipo 1 DENV-2 Dengue vírus sorotipo 2 DENV-3 Dengue vírus sorotipo 3 DENV-4 Dengue vírus sorotipo 4 DENV-5 Dengue vírus sorotipo 5 DES Funções Desconhecidas DIV Funções Diversas DMSO Dimetilsulfóxido DTT Ditiotreitol ECP Efeito Citopático FDR False Detection Rate FHD Febre Hemorrágica do Dengue FITC isotiocianato de fluoresceina MET Metabolismo Básico ml mililitro mm mili Molar MS2 Fracionamento de peptídeos em aminoácidos PBS Tampão fosfato salino PCR Reação em Cadeia da Polimerase PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonilo rpm Rotações por minuto RT-PCR Transcriptase Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase RTT Replicação Transcrição e Tradução SFB Soro Fetal Bovino TRANS Transporte TCID50 Dose infectiva para 50% do tecido em cultura SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA O vetor O vírus A dengue e o vetor O vírus e o vetor Proteômica da glândula salivar OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAL E MÉTODOS Criação e separação das fêmeas Amplificação Viral Infecção artificial dos mosquitos Dissecção da glândula salivar e separação para Biologia Molecular Extração do RNA viral e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) Proteômica da glândula salivar Análise dos dados de Proteômica RESULTADOS Infecção artificial dos mosquitos Dissecção das glândulas salivares e triagem para Biologia Molecular Confirmação da infecção artificial segundo a transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) Análise Proteômica Confirmações da infecção pelos sorotipos DENV-2 ou DENV-3 nos pools de glândulas salivares Determinação do conjunto total de proteínas e análise do Diagrama de Venn Proteínas com expressão diferenciada Comparação dos grupos de infecção (teste-t segundo p-valor )... 36 Comparação dos grupos de infecção (Benjamini-HochbergFDR) Identificação das principais proteínas e suas possíveis funções biológicas Identificação e comparação dos resultados com proteínas descritas na literatura sobre a glândula salivar de Ae. aegypti infectada ou não infectada DISCUSSÃO CONCLUSÃO PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 57 15 1. INTRODUÇÃO A dengue figura no cenário mundial como uma importante endemia afetando milhares de pessoas anualmente. Por não existir vacina contra a doença, se faz necessário um entendimento aprofundado das relações biológicas e evolutivas existentes entre o vetor, o vírus e o hospedeiro vertebrado. Muitos estudos têm procurado explicar a relação entre o arbovírus e o vetor buscando esclarecer os fatores associados à disseminação dos sorotipos virais, e as suas implicações na epidemiologia da doença. Dentro dessa temática, procura-se entender quais são as consequências que a infecção pelo vírus dengue causa não apenas no hospedeiro vertebrado, que apresenta manifestações clínicas da doença, mas também no hospedeiro invertebrado, o mosquito Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762). Nessa perspectiva, é de suma importância, entender quais são as implicações comportamentais, fisiológicas e biológicas que a infecção pelo DENV causam no vetor responsável pela sua multiplicação e circulação. No que concerne à transmissão do vírus, a glândula salivar de Ae. aegypti torna-se importante nos estudos da proteômica. As análises proteômicas do conteúdo salivar constituem um ponto de partida para os estudos de interação entre vetor e o parasito, propiciando conhecimento sobre os mecanismos de sua transmissão. 16 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. O vetor Ae. aegypti são mosquitos pertencentes a ordem Diptera, família Culicida, subfamília Culicinae, cujo espécimes do gênero Aedes apresentam hábito diurno, e, somente as fêmeas exercem a hematofagia (Forattini, 2002). Originário da África, o Ae. aegypti, atualmente, tem distribuição mundial. Acredita-se que essa dispersão tenha ocorrido de forma passiva, principalmente por meio das atividades humanas, de tal forma que desenvolveram durante sua trajetória evolutiva um comportamento estritamente sinantrópico e antropofílico (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994). Postula-se que o comércio de pneus usados tenha dado grande impulso a sua dispersão (Natal, 2002). No Brasil, o vetor foi erradicado na década de 50, sofrendo sucessivas re-infestações nos anos seguintes que foram controladas. Contudo, em 1976 ocorreu uma nova reintrodução e, não havendo êxito no seu controle, o mosquito Ae. aegypti se espalhou para todo o território brasileiro (Tauil, 2002). O Ae. aegypti é o principal vetor de três importantes arbovírus: febre amarela, chikungunya, dengue e, de outras arboviroses (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994; Morales Vargas et al., 2010). A espécie apresenta seu ciclo de vida associado aos regimes pluviais, de maneira que a incidência de casos de dengue está relacionada a fatores ambientais (aumento de temperatura, pluviosidade, umidade) que favorecem a disseminação do vetor devido ao aumento de criadouros para a espécie (Ribeiro et al., 2006). Alguns aspectos do comportamento de oviposição deste culicídeo permitem entender o sucesso da dispersão e distribuição da espécie: o primeiro refere-se ao fato dos ovos serem depositados acima da linha da água nos criadouros, que no caso de criadouros temporários, acabam sendo transportados passivamente pelas migrações humanas (Takahashi et al., 2005); o segundo, está relacionado à resistência do ovo à dessecação o que permite que os mesmos permaneçam alguns meses no ambiente (Natal, 2002) e o terceiro, ao comportamento de oviposição aos saltos onde a fêmea deposita seus ovos ao longo de vários criadouros (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994; Costa-Ribeiro, 2006). O vírus Os vírus dengue (DENV) são arbovírus pertencente ao gênero Flavivirus e família Flaviviridae que, além do DENV, engloba o vírus da febre amarela (YFV) o complexo do vírus da encefalite japonesa (JE), a encefalite de São Luís (SLEV), e o vírus do oeste do Nilo (WNV) (Figueiredo, 2007; Carroll et al., 2007). Composto por uma fita simples de RNA com cerca de onze mil pares de base (Rodenhuis-Zybert et al., 2010), o DENV apresenta alta variabilidade genética sendo caracterizado por apresentar cinco sorotipos diferentes (DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 e DENV-5), sendo que cada sorotipo pode ter vários genótipos (Pontes & Ruffino-Netto, 1994). Em 2013 o DENV-5 foi descoberto e caracterizado a partir do estudo de amostras de pacientes de um surto da doença que ocorreu na Malásia em 2007 (HealthSciencemag, 2013, Normile, 2013). Acredita-se que o desenvolvimento de formas graves da doença está associado a vários aspectos, além da resposta imune do hospedeiro, fatores associados aos sorotipos e aos genótipos virais também influenciam (Clyde et al., 2006). Por exemplo, verificou-se que pacientes infectados com DENV-2 tiveram casos mais graves da doença quando comparados à infecção com outros sorotipos (Vaughn et al., 2000; Fried et al., 2010). Ainda, vírus do dengue do sorotipo 2, genótipo do Sudeste-Asiático, são relatados como mais virulentos do que outros genótipos do DENV-2, sendo capazes de sobrepor a replicação do sorotipo DENV-3 em eventos de co-infecção no mosquito (Anderson & Rico-Hesse, 2006; Quintero- Gil et al., 2014). No que concerne à distribuição dos sorotipos virais do dengue, verifi
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