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ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA LIPOSSOMAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS POR VIAS NÃO-INVASIVAS: CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E FARMACOCINÉTICA USANDO CALCEÍNA COMO MARCADOR FLUORESCENTE Belo Horizonte 2009 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download. ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA LIPOSSOMAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS POR VIAS NÃO-INVASIVAS: CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E FARMACOCINÉTICA USANDO CALCEÍNA COMO MARCADOR FLUORESCENTE Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Fisiologia e Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Frederic Frezard Belo Horizonte 2009 À minha mãe, Leila, meu exemplo de vida, por toda a sua dedicação, garra, amizade, carinho e amor; ao meu irmão, Márcio Antônio, por toda a sua paciência e amizade, sempre me ensinando a dar prioridades; ao meu marido Enderson, por tudo o que ele é para mim: amor, confiança, amizade e companheirismo; à Sara, por todos os sorrisos, alegrias e beijos; a vocês, que sempre estiveram do meu lado com muito amor, me apoiando, incentivando, ajudando, perdoando e principalmente, acreditando na minha capacidade, eu dedico todo este trabalho. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Frezard, pela excelência na orientação do trabalho, pelos ensinamentos, paciência, respeito, confiança, amizade e por toda a sua ajuda nos momentos mais difíceis. Aos colegas de laboratório: Fernanda, Millen, Bruna, Rubens, Cláudio, Flaviana, Kelly, Vicente, Weverson e Raul pela convivência, amizade, carinho e ajuda nos experimentos. Aos alunos de iniciação científica Larissa e Warley, que muito me ensinaram e me ajudaram com os experimentos. Aos colegas Erly Azevedo e Fernanda Lemos, pela imensa ajuda com os ensaios de Células de Difusão de Franz. Ao Prof. Lucas Ferreira, da Escola de Farmácia, pela grande colaboração neste trabalho, principalmente com os ensaios de Células de Difusão de Franz, assim como os colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica. À Profa. Sílvia Andrade e suas alunas Juliana, Paula, Fernanda e Monalisa, pela ajuda nos ensaios in vivo, pelo empréstimo do biotério e laboratório e pela amizade. À Profa. Miriam Lopez, do Departamento de Farmacologia, por ter cedido os camundongos sem pêlos. Ao Prof. Valbert, da Escola de Farmácia, pela ajuda nas tentativas de marcar um peptídeo radioativamente. Ao Prof. Robson dos Santos, pelas discussões e ensinamentos durante o trabalho. À Ilma, por ter acolhido e cuidado dos camundongos no biotério. Aos colegas do laboratório de Hipertensão pela convivência e amizade. Ao Prof. Ruben Sinisterra, do Departamento de Química, pelo empréstimo do equipamento para as medidas de tamanho. À Celinha, por ter auxiliado na parte burocrática do doutorado. A todos os colegas da pós-graduação que conviveram comigo. Ao CNPq pelo auxílio financeiro. À Vovó Vera, pelo enorme apoio e incentivo, que apesar dos poucos anos de estudo, sempre soube da importância deste trabalho. A toda minha família: ao Gil, tios e tias, primos e primas, em especial a Bia, Fava, Carol e Nanda, pelo apoio, incentivo e amizade. RESUMO A principal vantagem da administração de medicamentos por vias não invasivas, como oral, nasal, pulmonar e tópica, é a facilidade de aplicação, o que contribui para aumentar a adesão do paciente ao tratamento. Fármacos hidrofílicos de massa molar intermediária ( Da) geralmente são pouco permeáveis através das membranas biológicas, e, por isto, apresentam baixa biodisponibilidade por essas vias. Estratégias estão sendo procuradas para superar esta limitação, e, entre as mais promissoras, destacam-se o uso de sistemas transportadores de fármacos, como os lipossomas. Os lipossomas ultradeformáveis, preparados com combinações específicas de fosfolipídios e tensoativos, permitindo a formação de vesículas altamente deformáveis ou elásticas, foram apresentados na literatura como um sistema carreador capaz de promover a absorção transdérmica de fármacos. Porém, o modo de atuação destas vesículas, quanto ao mecanismo de carreamento de fármacos e os fatores que determinam o nível de profundidade que os fármacos atingem após aplicação tópica, ainda não foi elucidado. Os lipossomas mucoadesivos, preparados com lipídios carregados negativamente e revestidos com polímeros catiônicos, mostraram-se capazes de aderirem na mucosa do trato gastrointestinal, resultando no aumento da biodisponibilidade dos fármacos encapsulados. Entretanto, há controvérsias se estes lipossomas permanecem estáveis no suco gástrico e na presença dos sais biliares, e, portanto, são capazes de controlar a liberação do fármaco encapsulado. Diante deste contexto, o objetivo dessa tese foi estudar aspectos físico-químicos e farmacocinéticos de lipossomas ultradeformáveis e mucoadesivos, visando esclarecer o modo de atuação e avaliar o verdadeiro potencial de utilização destas vesículas, principalmente para administração de fármacos hidrofílicos de massa molar intermediária. Neste trabalho, a calceína foi utilizada como marcador fluorescente e modelo de fármaco hidrofílico e de baixa permeabilidade através das membranas. Lipossomas ultradeformáveis, com diâmetro hidrodinâmico médio de 100 nm, foram preparados a partir de fosfatidilcolina de soja e colato de sódio, contendo calceína. A habilidade do íon Co 2+ de apagar a fluorescência da calceína permitiu a determinação da taxa de encapsulação e da permeabilidade da membrana dessas vesículas à calceína. Relatamos pela primeira vez que os lipossomas ultradeformáveis apresentam elevada permeabilidade à calceína, que foi explicada pelo efeito combinado do colato de sódio e do etanol na membrana dessas vesículas. Observamos ainda que a evaporação da água na formulação resulta no aumento da taxa de encapsulação da calceína, sugerindo que este fenômeno pode estar ocorrendo após aplicação tópica da formulação em condição não oclusiva. Tanto no estudo de absorção transdérmica da calceína para a circulação sanguínea, realizado em camundongos sem pêlo, quanto nos ensaios de permeação cutânea in vitro, utilizando Células de Difusão de Franz, as vesículas ultradeformáveis reduziram a taxa de calceína permeada. Leituras de fluorescência do fluido receptor, no ensaio de Células de Franz, na presença e ausência de Co 2+, mostraram que a calceína permeada pela pele encontra-se essencialmente na forma não encapsulada. Os resultados sustentam o modelo de que as vesículas ultradeformáveis não penetrariam nas camadas mais profundas da pele de forma intacta promovendo absorção transdérmica de calceína, mas atuariam como sistema de liberação sustentada, limitando tanto a permeação cutânea quanto a absorção transdérmica de calceína para a circulação. Lipossomas mucoadesivos, com diâmetro hidrodinâmico médio de 200 nm, contendo calceína, foram preparados a partir de diestearoilfosfatidilcolina, dicetilfosfato e colesterol, na razão molar de 8:2:1 e recobertos com o polímero catiônico, quitosana. O estudo de estabilidade mostrou que os lipossomas, tanto na presença ou ausência da quitosana, retiveram mais que 90% da calceína encapsulada, quando armazenados a 4ºC por até 14 dias. O estudo absorção por via oral, realizado em camundongos Swiss, indica que a calceína encapsulada em lipossomas sem e com quitosana mostrou a mesma farmacocinética plasmática que a calceína administrada na forma livre, sugerindo uma instabilidade dos lipossomas. Esta interpretação foi confirmada pelos ensaios de liberação da calceína in vitro, que mostraram que o ph ácido e a adição do tensoativo deoxicolato de sódio, como modelo de sal biliar, aumentaram a liberação de calceína dos lipossomas. Estes resultados deixam dúvidas em relação ao potencial destes lipossomas como sistema de liberação controlada de fármaco hidrofílico e de massa molar intermediária por via oral. Palavras-chave: lipossomas ultradeformáveis, absorção transdérmica, permeação cutânea, lipossomas mucoadesivos, absorção oral, calceína, farmacocinética, permeabilidade, quitosana. ABSTRACT The main advantage of the administration of drugs by non-invasive routes such as oral, nasal, pulmonary and topical, is the ease of application, which helps to increase adherence to the treatment. Hydrophilic drugs with intermediate molecular weight ( Da) generally are poorly permeable across biological membranes and show a low bioavailability by these routes. Strategies are being developped to overcome these limitations, and, among the most promising, is the use of drug carriers, such as liposomes. Ultradeformable liposomes, made from a specific combination of phospholipids and surfactants, allowing the formation of highly deformable and elastic vesicles were were presented in the literature as a unique carrier system capable of promoting transdermal drug absorption. The mode of action of these vesicles with respect to their mechanism of carrying and the factors that determine the depth of drug penetration after topical application, have not been elucidated so far. Mucoadhesives liposomes, prepared from negatively charged lipids and coated with cationic polymers, were found to adhere to the gastrointestinal mucosa, resulting in increased drug bioavailability. However, there is a controversy on whether or not these liposomes remain stable in the gastric fluid and in the presence of bile salts, being able to control the release of encapsulated drug. In this context, the goal of this thesis was to investigate the physico-chemical and pharmacokinetic characteristics of the ultradeformable and mucoadhesive liposomes, in order to clarify the mode of action and the therapeutic potential of these vesicles, mainly for the administration of hydrophilic drugs of intermediate molecular weight. In this work, calcein was used as fluorescent marker and a model of hydrophilic and low membrane permeability drug. Ultradeformable liposomes, with average hydrodynamic diameter of 100 nm, were prepared from soya phosphatidylcholine and sodium cholate in the presence of calcein. The ability of Co 2+ ion to quench the fluorescence of calcein allowed determining the drug encapsulation efficiency and the membrane permeability to calcein of ultradeformable vesicles. For the first time, we report that ultradeformable liposomes exhibited high membrane permeability to calcein, which was explained by the combined effect of sodium colate and ethanol on the liposome membrane. We observed that the evaporation of water in the formulation resulted in increasing the calcein encapsulation efficiency, suggesting that this phenomenon may occur after topical application of the formulation under nonocclusive condition. In both the in vivo transdermal (percutaneous) absorption of calcein to the blood circulation, carried out in mice Hair Less, and the in vitro percutaneous skin permeation, using Franz Diffusion Cells, the ultradeformable vesicles reduced the rate of calcein permeated. The fluorescence measurements of the receptor fluid of the Franz diffusion cell in the absence and presence of Co 2+ revealed that the permeated calcein existed essentially under the non-encapsulated form. Our results supports the model that ultradeformable vesicles do not penetrate intact into the deeper layers of the skin, but act as sustained release system, limiting both the cutaneous permeation and the transdermal absorption of calcein to the blood circulation. Mucoadhesives liposomes, with average hydrodynamic diameter of 200 nm, containing calcein were prepared from distearoylphosphatidylcholine, dicetylphosphate and cholesterol, at molar ratio of 8:2:1, and coated with the chitosan cationic polymer. The stability study showed that the liposomes, both in the presence and absence of chitosan, were able to retain more than 90% of calcein encapsulated when stored at 4 C for 14 days. The oral absorption study, performed in Swiss mice, evidenced that liposome encapsulated calcein, with and without chitosan, showed plasma pharmacokinetics similar to the free calcein, suggesting instability of these liposomes. This interpretation was supported by in vitro release study of calcein from the liposome suspension, which showed that the acidic ph or the addition of sodium deoxycholate, used as a model of bile salt, increased the release of calcein from liposomes. Our results support the model that these liposomes, given orally, are not stable enough to act as a sustained release of hydrophilic drug of intermediate molecular weight. Keywords: ultradeformable liposomes, transdermal absorption, cutaneous permeation, mucoadhesive liposomes, oral absorption, pharmacokinetics, calcein, permeability, chitosan. Lista de Figuras LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação esquemática da estrutura da pele Figura 2: Representação esquemática do estrato córneo e de duas vias para a absorção de substâncias pela pele Figura 3: Representação esquemática das camadas do trato gastrointestinal Figura 4: Características estruturais dos lipossomas Figura 5: Transição de fases das membranas lipídicas e o efeito do colesterol Figura 6: Lipossomas incorporando diferentes substâncias funcionalizantes Figura 7: Representação esquemática de uma vesícula ultradeformável Figura 8: Estrutura química da quitosana Figura 9: Estrutura da calceína no ph Figura 10: Representação esquemática do modo de preparo dos lipossomas ultradeformáveis Figura 11: Representação esquemática do método utilizado para determinação da permeabilidade da membrana dos lipossomas à calceína Figura 12: Representação esquemática do procedimento para avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína Figura 13: Representação esquemática de uma Célula de Difusão de Franz Figura 14: Cinética de incorporação de calceína em lipossomas ultradeformáveis de diferentes composições Figura 15: Deformabilidade de lipossomas de diferentes composições lipídicas.. 73 Figura 16: Relação entre a intensidade de fluorescência e a concentração de calceína em plasma de animais Figura 17: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando aplicada topicamente em camundongos sem pêlo em diferentes formas Figura 18: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando aplicada topicamente em camundongos sem pêlo a partir de lipossomas ultradeformáveis constituídos de SPC ou EPC Figura 19: Farmacocinéticas plasmáticas de calceína quando aplicada topicamente em camundongos sem pêlo a partir de diferentes formulações Lista de Figuras Figura 20: Quantidades de calceína incorporada na derme e depositada na superfície do estrato córneo em camundongos sem pêlo Figura 21: Porcentagens acumuladas de calceína permeada através da pele do dorso de camundongos sem pêlo nos experimentos de Células de Franz Figura 22: Curvas de regressão linear para as relações de % de calceína permeada em função de t ou em função de (t) em experimentos de Células de Franz Figura 23: Sinais de fluorescência dos líquidos receptores antes e após a adição de CoCl 2 e Triton X Figura 24: Representação esquemática do modo de preparo dos lipossomas aniônicos e mucoadesivos Figura 25: Representação esquemática do ensaio de estabilidade dos lipossomas mucoadesivos Figura 26: Representação esquemática do procedimento utilizado para o estudo da absorção da calceína por via oral Figura 27: Cinéticas de liberação de calceína a partir de lipossomas armazenados a 4ºC com e sem quitosana Figura 28: Farmacocinéticas plasmáticas da calceína, em camundongos Swiss, após administração oral de diferentes formulações Figura 29: Efeito do deoxicolato na taxa (%) de calceína liberada de lipossomas aniônicos (sem quitosana) ou de lipossomas mucoadesivos (com quitosana), em meios de diferentes phs Figura 30: Influência do ph do meio na taxa (%) de calceína liberada de lipossomas mucoadesivos ou de lipossoma sem quitosana Lista de Tabelas LISTA DE TABELAS Tabela 1: Fosfatidilcolina utilizadas no preparo de lipossomas: temperatura de transição de fase e estado físico da membrana formada a 37ºC Tabela 2: Composição química das vesículas ultradeformáveis utilizadas para a administração transdérmica de diferentes fármacos Tabela 3: Meios utilizados para avaliação da interferência dos componentes das vesículas ultradeformáveis em ensaios in vitro e in vivo Tabela 4: Eficiência de encapsulação da calceína em suspensões de lipossomas ultradeformáveis preparados em diferentes concentrações Tabela 5: Permeabilidade à calceina, a 25 C, de dif erentes membranas: influência da razão fosfolipídio/colato, da concentração total da suspensão e do tipo de fosfolipídio Tabela 6: Dados relativos à precisão do método de dosagem da calceína no plasma de animais Tabela 7: Valores médios ± DP dos coeficientes de regressão linear para as relações de % de calceína permeada in vitro em função de t (modelo 1) ou em função de (t) (modelo 2) Tabela 8: Frações de calceína encapsulada (não acessível ao íon cobalto) determinadas no fluído receptor da Célula de Franz 2 e 8 horas após aplicação tópica de calceína encapsulada em lipossomas ultradeformáveis ou livre em colato e etanol, em pele de camundongos sem pêlo... 90 Lista de Abreviaturas LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS C e : concentração molar do fármaco no fluido doador C i : concentração molar do fármaco no fluido receptor CHOL: colesterol COL: colato de sódio CV: coeficiente de variação DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina DP: desvio padrão DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina DSPC: distearoilfosfatidilcolina EPC: fosfatidilcolina natural de ovo J: fluxo do fármaco através da pele LD: limite de detecção LQ: limite de quantificação M: concentração média P: coeficiente de permeabilidade SPC: fosfatidilcolina natural de soja Tf: temperatura de transição de fase Sumário SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... 1 LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS SUMÁRIO INTRODUÇÃO VIAS NÃO INVASIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS Via tópica Via oral Lipossomas como carreadores de fármacos Lipossomas: estrutura, composição e propriedades básicas Lipossomas ultradeformáveis Lipossomas mucoadesivos Calceína como marcador de lipossomas OBJETIVOS CAPÍTULO 1: LIPOSSOMAS ULTRADEFORMÁVEIS PARA ADMINISTRAÇÃO TRANSDÉRMICA DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Preparação das formulações de calceína Caracterização físico-química dos lipossomas ultradeformáveis Validação do método fluorimétrico de dosagem da calceina presente em plasma de animais Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de lipossomas ultradeformáveis Avaliação da permeação cutânea in vitro da calceína a partir de lipossomas ultradeformáveis Aspectos éticos no manuseio dos animais RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização físico-química dos lipossomas ultradeformáveis... 66 Sumário 3.2. Validação do método de dosagem por fluorimetria da calceína em plasma de animais Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de lipossomas ultradeformáveis Avaliação da permeação cutânea da calceína in vitro a partir dos lipossomas ultradeformáveis Avaliação da porcentagem de encapsulação da calceína após permeação pela pele CONSIDERAÇÕES FINAIS CAPÍTULO 2: LIPOSSOMAS MUCOADESIVOS PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS Preparação da solução de quitosana Preparação da formulação de lipossomas mucoadesivos Caracterização físico-química dos lipossomas mucoadesivos Avaliação da absorção de calceína por via oral a partir de lipossomas mucoadesivos Liberação da calceína a partir das formulações de lipossomas em diferentes meios simulando os fluídos biológicos Aspectos éticos no manuseio dos animais RESULTADOS E DISCUSSÃO Caracterização físico-química dos
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