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BIOTECNOLOGIA: melhoramento genético vegetal

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BIOTECNOLOGIA: avanços e aplicações no melhoramento genético vegetal Márcio Elias Ferreira, Ph.D. Laboratório de Genética EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia Características
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BIOTECNOLOGIA: avanços e aplicações no melhoramento genético vegetal Márcio Elias Ferreira, Ph.D. Laboratório de Genética EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia Características poligênicas poligênicas Híbrido e njunto de técnicas que utilizam os seres vivos no desenvolvimento de processos e produt Características poligênicas poligênicas Híbrido e s variedades de plantas de diferentes espécies cultivadas foram senvolvidas, em sua grande maioria, com base na seleção fenotípica de racterísticas de interesse econômico. nótipo representa o efeito coletivo dos genes expressos em interação com ambiente. Sucesso: métodos de melhoramento genética quantitativa (herdabilidade variância genética, correlaçã genética), estatística, fitotecnia Desconhecimento da arquitetur genética por traz do fenótipo: não s sabe quais são os genes e o pape destes genes no fenótipo. Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e Melhoramento Convencional Cruzamento de melhores materiais Seleção de recombinantes baseada em fenótipo Fixação do genótipo desejado em linhagens ou híbridos Modelo infinitesimal de Fisher EFICIENTE: não precisa de informação sobre número de locos, efeito, localização, sequência gênica, função gênica Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e 8 e a Revolução Verde Características poligênicas poligênicas Híbrido e Comparação de alelo sd-1 de IR8 e Dee-geo-woo-gen com alelo de planta normal: mutante tem deleção de 383 pb que cria um stop códon outros três alelos sd-1 (semi-anão) apresentam substituição de aminoácido (linhagen derivadas de Jikkoku, Calrose 76 e Reimei. GA20 oxidase do loco sd-1 expressa nas folhas, caule e flores fechadas. Deleção leva ao porte semi-anão. Característica monogênica com grande efeito em característica quantitativa: arquitetura. Características poligênicas poligênicas Híbrido e ovamente, ão foi necessário conhecimento de localização, efeito, ordem, sequência ou unção para desenvolver as variedades de arroz altamente produtivas da evolução Verde. uso de ferramentas moleculares proporciona o umento da eficiência dos programas de elhoramento genético para características uantitativas? Características poligênicas poligênicas Híbrido e s duas principais linhas de melhoramento molecular, isto é, do melhoramento genético que incorpora estratégias, métodos e conhecimentos de genética molecular na manipulação de seqüências de DNA que afetam o fenótipo de interesse, incluem: 1) a inserção direta de genes por diferentes estratégias de engenharia genética nas espécies de interesse e 2) a seleção baseada na detecção de variação genotípica associada à variação fenotípica nos programas de melhoramento genético. Características poligênicas poligênicas Híbrido e ipicamente busca genes que representam ovidade na espécie. s genes, em geral, são oriundos de spécies completamente diferentes da spécie-alvo. nova característica agrega valor à espécie lvo. rincipais genes comerciais: esistência a insetos (Bt) esistência a herbicida (glifosato) Características poligênicas poligênicas Híbrido e ucesso no desenvolvimento de variedades com características controladas por um único gene; enes em geral representam novidade à espécie; Características poligênicas poligênicas Híbrido e empo de desenvolvimento varietal: similar ao melhoramento convencional (aproximadamente 10 anos, Gepts, 2002); conversão idem. identificação do gene de interesse em espécie de taxa distante clonagem do gene construção de vetores transformação seleção de transgênicos com expressão adequada da característica de interesse utros fatores (política, regulamentação e propriedade intelectual) podem estender ainda mais os prazos de desenvolvimento varietal. Limitação: Características poligênicas poligênicas Híbrido e Banco de genes de interesse econômico está restrito a poucos exemplos (ex. Bt, resistência a herbicida, resistência a patógenos); Características poligênicas poligênicas Híbrido e mitação: Engenharia Genética de características quantitativas anco não inclui, na prática, genes ou reguladores de expressão para melhoramento de características quantitativas. Previsão: longo prazo. narciso Erwinia narciso Narciso Erwinia Narciso Milho Erwinia Narciso Características poligênicas poligênicas Híbrido e Engenharia genética, a curto prazo, não substitui melhoramento clássico. Seu principal atributo e contribuição é a incorporação de novidade à espécie de grande interesse econômico. Engenharia genética de metabolismo para aumentar eficiência enzimática está em sua infância. Engenharia genética não parece ser possível, a curto prazo, no melhoramento de características quantitativas. LEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES - poderá eventualmente substituir à análise fenotípica utilizada nos programas de melhoramento? otivação para uso é antiga no melhoramento: leção indireta de uma característica de fácil f fenotipagem como critério rio de seleção para uma característica complexa; leção direta do genótipo desejado. Características poligênicas poligênicas Híbrido e. x, K The association between size differences with seed-coat pattern and pigmentation in Phaseolus vulgaris.. Genetics 8: oday, J.M Location of polygenes. Nature 191: lecular tstein, D.; White, R.L.; Skolnick, M. and Davis, R.W Construction of a genetic linkage map n man using restriction fragment length polymorphisms. s. Am. J. Hum. Genet. 32: wards, M.D.; Stuber, C.S.; Wendel, J.F Molecular-marker marker-facilitated investigations of quantitative-trait trait loci in maize. I-I Numbers, genomic distribution and types of gene action. Genetics 116: terson, A.H.; Lander, E.S.; Hewitt, J.D.; Paterson, S.; Lincoln, n, S.E. and Tanksley, S.D Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete Características poligênicas poligênicas Híbrido e EFINIÇÃO: é toda sequência de DNA xpresso ou não) capaz de detectar LIMORFISMO de sequência e que possui comportamento MENDELIANO. ibridização CR CR seguido de fragmentação ragmentação seguida de PCR arcação por fluorescência arcação por nitrato de prata arcação por brometo de etídio arcação por 32 P ou 33 P APLICAÇÃO: Filogenia Diversidade genética Análise de vínculo Estrutura de populações Evolução Construção de mapas genéticos Mapeamento qualitativo Mapeamento de QTLs Clonagem posicional Seleção assistida Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e so amplo (rotina): Exemplos: RFLP, RAPD, SSR, SNP, DArT Incorporar genes de resistência a doenças de difícil avaliação fenotípica ou que requerem avaliação múltipla; Piramidizar genes que conferem resistência a isolados do mesmo patógeno (o que é impossível de ser conduzido por inoculação simultânea em programa convencional de melhoramento). Conversão de linhagens (retrocruzamento assistido) Características poligênicas poligênicas Híbrido e nversão de linhagens (retrocruzamento assistido, background selection) Características poligênicas poligênicas Híbrido e nversão de linhagens (retrocruzamento assistido,seleção de background) Duas gerações de retrocruzamento com seleção de backgroung atinge ~93% de conversão (sem seleção é ~87,5%). Grande ganho no tempo de lançamento varietal. Justificável - seleção baseada no fenótipo menos eficiente e mais onerosa do qu baseada em polimorfismo de DNA Características poligênicas poligênicas Híbrido e Potencial uso de seleção indireta par característica de interesse (seleçã assistida) para desenvolvimento varieta Características poligênicas poligênicas Híbrido e aracterísticas quantitativas: uso nulo ou limitado de seleção assistida Grande desenvolvimento da teoria de seleção assistida (Dekkers and Hospital, 2002; Dreher et al., 2003). Emprego em espécies modelo começa a se desenvolver (incipiente); Emprego em espécies órfãs : nulo Características poligênicas poligênicas Híbrido e AS - interessante em situações em que a herdabilidade é intermediária e há grande dificuldade ou custo na fenotipagem (Moreau et al., 1998) enotipagem da característica de interesse é difícil (ex. resistência a nematóide do cisto em soja Heterodera glycines), a seleção assistida por marcador fortemente ligado a gene de interesse tem grande atrativo para ser adotada em rotina pelos programas de melhoramento genético por facilitar o processo de fenotipagem (Young, 1999). Características poligênicas poligênicas Híbrido e e todos os genes que controlam uma característica pudessem ser mapeados e os seus efeitos mensurados, a processo de seleção indireta poderia ser mais eficiente ontudo, s QTLs mapeados em geral são de grande efeito, relativamente àqueles que também contribuem para o fenótipo, em contraposição ao modelo infinitesimal. polimorfismo de DNA nestas regiões nem sempre é observado entre as linhagens parentais e do grau de isolamento genético entre elas. epende do próprio processo de fenotipagem, que para características quantitativas não guarda uma correlação alta com o genótipo da característica de interesse. o longo das gerações e por efeito da recombinação, o desequilíbrio de ligação é diminuído e a eficiência de seleção indireta diminui. Características poligênicas poligênicas Híbrido e Clonagem posicional Espécie Característica QTL Gene Função arabidopsistempo florescimento ED1 CRY2 criptocromo arroz abscisão de grãos Sh4 Sh4 regulatória arroz abscisão de grãos qsh1 qsh1 regulatória arroz capacidade regeneração PSR1 PSR1 redutase ferrodoxina-nitrato arroz número de grãos Gn1a OxCKX2 oxidase/desidrog citocinina arroz perfilhamento moc1 Moc fator transcrição arroz submergência Sub1A Sub1A fator de transcrição arroz tamanho de grão GS3 GS3 proteína transmembrana arroz tempo florescimento Hd1 Se1 fator transcrição (Constans) arroz tempo florescimento Hd6 CK2 quinase arroz tempo florescimento Hd3a Hd3a ni arroz tempo florescimento Edh1 Edh1 regulatória arroz tolerância a salinidade SKC1 SKC1 bomba de sódio milho dominância apical Tb1 Tb1 fator transcrição milho tempo florescimento dwf1 dwf1 regulatória tomate conteúdo açúcar Brix9-2-5 Lin5 invertase apoplástica tomate forma do fruto ovate ovate desconhecido tomate tamanho de fruto fw2.2 OFRX regulatória Poucos exemplos: Seleção assistida baseada diretamente na genotipagem do gene no QTL de interesse Características poligênicas poligênicas Híbrido e uso de seleção assistida depende, fundamentalmente, da vantagem econômica em utilizar a tecnologia em relação a um programa convencional de seleção. Características poligênicas poligênicas Híbrido e iramidização de genes de resistência à Magnaporthe em arroz e desenvolvimento de multilinhas; Fenotipagem RC1 Seleção assistida Fenotipagem RC2 Seleção assistida Piramidização multilinhas Impacto: Experimento em RC3. Piramidização de genes de resistência a diferentes raças do mesmo patógeno com screening simultâneo é complexo; Características poligênicas poligênicas Híbrido e Impacto: Experimento em RC1. Avaliação para qualidade de grãos é feita somente em estágios avançados do programa. Neste caso, a avaliação é precoce. Qualidade de grãos STRs flanqueando genes de interesse Sintase de amido (SSII-3; SSII-2; waxy ADP-glucose pirofosforilase (AGPase LS; AGPase SS) Ramificação de amido (SBE I; SBE IIa; SBE IIs) Desramificação amido (DBE-isoamilase) Alta qualidade grãos Média produtividade Média qualidade grãos Alta produtividade Outros QTLs Alta qualidade grãos Alta produtividade Características poligênicas poligênicas Híbrido e AB-QTL (Advanced Backcross QTL Analysis) Tanksley & Nelson, 1996). PASSOS: mapeamento de QTLs em cruzamentos amplos seleção de QTLs cujos alelos positivos são rovenientes do doador. Análise de fenótipo em geração avançada de etrocruzamento O. sativa BG 90-2 X O. glumaepatula RS 16 BG 90-2 X F1 Seleção de linhagens quase-isogênicas com base m informação de QTLs PRODUTOS: BG 90-2 seleção X RC1 seleção RC2 Construção do mapa genético MAPEAMENTO DE QTLs linhagens quase-isogênicas contendo alelos esejáveis para características quantitativas ntrogredidos de doador silvestre X RC2F2 (...) X Fenotipagem Aumento de diversidade genética dos programas RC2F3 Diminuição do efeito de linkage drag Uso de acessos do banco de germoplasma (...) seleção X RC2F7 Linhagens quase-isogênicas or que em certos cruzamentos o híbrido F1 é superior à performance das inhagens parentais homozigotas, ou da mais vigorosa das linhagens arentais? Hipóteses efeitos não aditivos no fenótipo. Características poligênicas poligênicas Híbrido e DOMINÂNCIA - onde conjuntos independentes de alelos com pequeno efeito deletério, acumulados no genoma pela autofecundação de linhagens parentais, atuam de forma complementar quando presentes no híbrido (F1) das linhagens parentais. As linhagens parentais, pelo contínuo aumento de homozigose a cada geração de autofecundação, apresentam um efeito de depressão por endogamia, fenômeno geralmente associado ao vigor híbrido. SOBREDOMINÂNCIA - interações alélicas em um loco heterozigoto atuam de forma sinergística entre os alelos para aumentar o vigor da planta. Características poligênicas poligênicas Híbrido e Explica também porque distância genética, por si só, nã é um bom estimador de vigor híbrido (a) Vigor Híbrido (b) Depressão por endogamia Corrobora hipótese de dominância. Características poligênicas poligênicas Híbrido e É possível afirmar que a genotipagem vai se tornar mais econômica (e fácil) do que a fenotipagem. com um único ensaio ( corrida ) de seqüenciamento por síntese baseado em polimerase é possível re-sequenciar em 4 dias cerca de 1300 milhões de pb, com fragmentos de aproximadamente pb na plataforma Illumina (http://www.illumina.com). Na plataforma Roche-454 (http://www.454.com ), baseada na técnica de pirosequenciamento, é possível em apenas 7 hs e em uma única corrida obter cerca de 100 Mpb, com comprimento de fragmentos seqüenciados em torno de 250 pb. Outra possibilidade é o emprego da plataforma SOLiD Applied Biosystems, que o seqüenciamento baseado em ligação, capaz de gerar Mpb em uma corrida no período de cinco dias, com tamanho de fragmento na ordem de 35 pb (http://marketing.appliedbiosystems.com/images/product/solid_knowledge/flash/ /solid.html ). onclusões e Perspectivas Características poligênicas poligênicas Híbrido e s contribuições de áreas de biologia molecular, genética molecular e genômica para o conhecimento básico da constituição biológica dos organismos é inquestionável. á o emprego de tecnologias derivadas deste conhecimento em soluções práticas no melhoramento de plantas, notadamente nas rotinas de um programa de desenvolvimento varietal, é ainda limitado. engenharia genética tem tido impacto reconhecido na introgressão de genes de herança qualitativa, oriundos de espécies filogeneticamente distantes da espécie agrícola de interesse, mas que conferem um alto valor agregado à variedade transgênica. orém, o repertório gênico com impacto comercial é ainda limitado a poucos exemplos, como resistência a herbicida e resistência a insetos. Características poligênicas poligênicas Híbrido e engenharia genética para características quantitativas ainda espera por um exemplo prático, de grande impacto comercial. Características poligênicas poligênicas Híbrido e genética molecular, através do emprego de marcadores moleculares, tem contribuído em várias áreas da biologia e do agronegócio. o melhoramento genético a seleção indireta com marcadores moleculares tem sido empregada com sucesso em programas de retrocruzamento e conversão de linhagens, tanto para genes de herança simples (incluindo transgenes) quanto para QTLs de forte efeito na variação fenotípica. arcadores moleculares utilizados no mapeamento e clonagem posicional vêm apresentando grande avanço no conhecimento, possibilitando a clonagem de QTLs e a compreensão do seu papel no fenótipo de uma característica quantitativa. ontudo, o impacto da seleção assistida por marcadores moleculares no melhoramento de características quantitativas é ainda incipiente. ste impacto tem se revelado mais promissor quando em combinação com avaliação fenotípica. Características poligênicas poligênicas Híbrido e Características poligênicas poligênicas Híbrido e re-seqüenciamento em escala do genoma estrutural aponta para o conhecimento da base molecular de fenômenos de grande interesse para o melhoramento genético, como heterose. seu desvendamento por certo levará ao desenvolvimento de estratégias combinadas de genética molecular e melhoramento para a seleção de genótipos superiores e com maior vigor híbrido e menor depressão por endogamia. Características poligênicas poligênicas Híbrido e O melhoramento clássico, sem dúvida, continuará a desenvolver as variedades melhoradas para a agricultura, como sempre o fez, independentemente do conhecimento dos genes e do controle que exercem sobre a fisiologia da característica de interesse. A redução dos custos de análise molecular promoverá uma integração cada vez maior do melhoramento clássico com os avanços da biotecnologia nos próximos anos. Características poligênicas poligênicas Híbrido e m um futuro próximo, portanto, não parece actível a substituição da seleção fenotípica, ue caracteriza os programas de elhoramento, pela seleção genotípica, aseada na análise de variação alélica nos ocos gênicos, ou locos de marcadores oleculares em desequilíbrio de ligação omo os locos que controlam a aracterística de interesse. ão parece factível, ainda, a substituição do elhoramento clássico pela engenharia enética. arece adequado supor que, ao invés de ubstituição haverá, na verdade, uma ntegração cada vez mais intensiva de écnicas de engenharia genética, arcadores moleculares e genômica no elhoramento genético.
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