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Dinâmica Molecular do Peptídeo Antimicrobial LL-37 em um Modelo de Surfactante Pulmonar

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Dinâmica Molecular do Peptídeo Antimicrobial LL-37 em um Modelo de Surfactante Pulmonar Aluno: Lucas Miguel Pereira de Souza Orientador: André Silva Pimentel Introdução As catelicidinas são um grupo de
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Dinâmica Molecular do Peptídeo Antimicrobial LL-37 em um Modelo de Surfactante Pulmonar Aluno: Lucas Miguel Pereira de Souza Orientador: André Silva Pimentel Introdução As catelicidinas são um grupo de peptídeos antimicrobianos que possuem propriedades antibacterianas, antifúngicas, antivirais, imunoestimulatórias e imunomoduladoras. A família das catelicidinas é caracterizada por um domínio catelin N-terminal altamente conservado e um domínio antimicrobial C-terminal variável [1] que pode ser extraído pela ação de proteinases [2]. A catelicidina atua juntamente com as defensinas e altas concentrações de catelicidina são encontradas em sítios de inflamação, onde parecem estar destruindo microorganismos e atuando como uma ponte entre as imunidades inata e tardia [6]. A observação que os peptídeos antimicrobianos são também produzidos no epitélio sustenta a hipótese de que sejam parte de um tipo de sistema de defesa primária [7]. LL-37 é a parte C-terminal da catelicidina humana (hcap-18). Conhecido por suas atividades antimicrobianas, o LL-37 foi simulado em um modelo de surfactante pulmonar. Os peptídeos antimicrobianos coadministrados por surfactantes têm surgido como uma alternativa para a administração de antibióticos por via intravenosa, uma vez que permitem a distribuição dos peptídeos nas vias aéreas e abrem as regiões colapsadas do pulmão [3]. O peptídeo antimicrobiano LL-37 tem uma papel fundamental no mecanismo de defesa ímune inato [8] e exibe um amplo espectro de atividade microbial contra bactérias, fungos e viroses [9]. Os surfactantes pulmonares são monocamadas fosfolipídicas que atuam reduzindo a tensão superficial dos pulmões. São produzidos por seres humanos nas últimas semanas de vida uterina, e podem também ser extraídos de animais. Os surfactantes podem ser sintéticos, naturais modificados ou naturais. Para a simulação, buscou-se produzir um filme aproximadamente igual ao BLES (Bovine Lipid Extract Surfactant). Para tanto, foram utilizados os lipídeos DPPC (Dipalmitoilfosfatidilcolina), POPC (1-Palmitoil-2- oleoilfosfatidilcolina), POPG (1-palmitoil-2-oleoilglicero-3-fosfoglicerol) e POPE (1- palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina), e colesterol [4,5]. Objetivo O objetivo deste trabalho é simular a adsorção do peptídeo antimicrobial LL-37 em um modelo de surfactante pulmonar através de dinâmica molecular coarse grained. O intuito disto é verificar a viabilidade de utilizar o surfactante pulmonar como carreador do peptídeo antimicrobial LL-37 para o pulmão. Metodologia As simulações foram executadas pelo programa Gromacs As simulações foram executadas em coarse grained pelo campo de força Martini 2.0. No campo de força em questão, no geral, 4 átomos pesados são transformados em um grão. Os parâmetros do campo de força do Martini para os lipídeos e para o colesterol foram obtidos através do Martini Lipidome, disponibilizado em sua página. A figura 1 mostra as moléculas ou resíduos no campo de força coarse grained. O script INSANE foi utilizado para a construção de um sistema constituído por duas monocamadas concatenadas com uma caixa d água de 25 x 25 x 6 (nm) no meio, segundo a Figura 2. Cada monocamada possui 1024 moléculas, sendo estas DPPC, POPC, POPG, POPE e colesterol na proporção de 8,2:7,2:2,0:1,0:1,6. Além disso, foram adicionados íons para neutralizar o sistema, que possui lipídeos com carga negativa (um total de -204). Usando o comando gmx editconf o sistema foi configurado em uma caixa de dimensões 25 x 25 x 40 (nm), que permitiu 15 nm de vácuo na parte superior e inferior. (A) (B) (C) (D) (E) (F) (G) (H) (I) Figura 1: Moléculas ou grupos de moléculas no campo de força Martini Coarse Grained. (A) representa a molécula de DPPC, (B) POPC, (C) POPG, (D) POPE, (E) colesterol. Quanto aos lipídeos (A D), os grãos azuis-claros representam a cauda, enquanto os demais (rosa, bege e azul escuro), a cabeça. (F) Representa a água (cada grão representa 4 moléculas de água). (G) Representa o peptídeo LL-37. (H) Representa o íon cloreto, e (I), o cátion sódio (cada grão representa 4 íons). Figura 2: Caixa com o filme. Os grãos azuis-claros representam as caudas (apolares) dos lipídeos, enquanto as cabeças (polares) estão representadas pelas cores azuis-escuras. No centro, em verde, a caixa d água é representada. Em rosa, colesterol. Depois de pronto, o sistema foi minimizado usando o algoritmo steepest descent. A minimização de energia é um passo necessário para evitar sobreposição de átomos e para relaxar o sistema. A minimização é executada até o sistema atingir o valor de 100 kj mol -1, que é um valor padrão e bem testado. Logo após, o sistema foi equilibrado termodinamicamente utilizando o algoritmo leap frog, com um tempo de simulação de 100 ns. O passo seguinte é a dinâmica molecular, cujo tempo de simulação foi de 2 μs, também com o algoritmo leap-frog. Esses dois últimos passos contam com o acoplamento de temperatura e pressão. O termostato utilizado é o v-rescale, e o barostato, berendsen do tipo surface-tension, procedimentos realizados com os parâmetros de temperatura de 298K e pressão de 1 atm. Com respeito ao peptídeo, seu arquivo foi obtido do AMP Database. O script Martinize foi utilizado para configurar o peptídeo no campo de força Martini e gerar sua topologia e parâmetros. Configuradas as coordenadas, o peptídeo foi inserido na caixa com o filme. O peptídeo foi posicionado na parte superior a 5 nm de distância da monocamada superior, conforme a figura 3. Mais íons foram adicionados, uma vez que o peptídeo possui uma carga positiva (+8). A partir disso, seguiram-se as mesmas etapas anteriores: minimização de energia, equilíbro e dinâmica molecular. Todas se seguiram de maneira idêntica às anteriores, exceto pelas seguintes mudanças: o equilíbrio foi realizado com restrição de posição para evitar que o peptídeo entre na monocamada antes da dinâmica molecular; na etapa da dinâmica molecular, o tipo de acoplamento de pressão é do tipo surface-tension, que permite que a simulação possa ser realizada em diferentes tensões superficiais. Portanto, foram realizadas 3 simulações com as tensões superficiais de 30, 40, e 50 mn m -1. O sistema, e sua mudança com o tempo foram visualizados utilizando o programa VMD [10]. Figura 3: Peptídeo acima dos lipídeos, no vácuo. Resultados A partir dos cálculos computacionais realizados, pôde-se obter informações a respeito do filme com a proteína. Primeiro, observou-se, durante a dinâmica, que a proteína entra naturalmente na monocamada, se localizando preferencialmente entre as cabeças polares e a caixa d água durante a maior parte do tempo, como mostra a figura 4: Figura 4. Representação do peptídeo após entrar na monocamada durante a dinâmica molecular. A camada de água no centro e a distinção entre a cauda e a cabeça dos lipídeos foram omitidas. Um dos parâmetros analisados foi a área por lipídeo nas diferentes tensões. A tabela 1 mostra os resultados: Tensão (mn m -1 ) Área por Lipídeo (Ǻ 2 por molécula) 30 54, , ,7 Tabela 1: Área por lipídeo de acordo com as tensões Os parâmetros de ordem para o DPPC também foram obtidos. Foram calculados os parâmetros para as duas caudas (sn1 e sn2), no entanto os valores são os mesmo conforme mostrado na figuras 5. Também foram obtidos os parâmetros de ordem para os demais lipídeos, porém, os resultados foram muito semelhantes, com poucas variações. Figura 5: Parâmetros de ordem da primeira cauda, sn1 A densidade (kg m -3 ) também foi calculada. Foi calculada a densidade de dois grupos: as cabeças polares e as caudas de todos os lipídeos presentes, em todas as três tensões. As Figuras 6 e 7 representam as densidades nas tensões de 40 e 50. Como pode se observar as densidades se sobrepõem, ou seja, praticamente não variam de acordo com a tensão. Figura 6: Densidade das cabeças polares nas tensões de 40 e 50, em função da posição relativa ao centro (nm). Observa-se que se sobrepõem. Figura 7: Densidade das caudas apolares nas tensões de 40 e 50, em função da posição relativa ao centro (nm). Estas também se sobrepõem. A difusão lateral dos lipídeos foi calculada, e os resultados seguem na Tabela 2, respectivas às diferentes tensões superficiais. Tensão Superficial (mn m -1 ) Difusão Lateral (10 7 cm 2 s 1 ) DPPC 30 15, , ,8 POPC 30 15, , ,1 POPG 30 16, , ,5 POPE 30 16, , ,7 Conclusões As dinâmicas foram realizadas com sucesso, não mostrando nenhum tipo de colapso ou incompatibilidade. Portanto, as propriedades interfaciais do surfactante pulmonar são mantidas na presença do LL-37. As implicações disto é que existe uma grande chance do surfactante pulmonar poder ser utilizado como carreador do LL-37 para ser administrado localmente nos alvéolos do pulmão, fato este que ainda precisa de confirmação por testes in vitro e in vivo. Referências 1 MÉNDEZ-SAMPERIO, P. The human cathelicidin hcap18/ll-37: a multifunctional peptide involved in mycobacterial infections. National Center for Biotechnology Information. Setembro de 2010, seção Peptides. Disponível em: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ . Acesso em 25 de julho de Sørensen, Ole E. Human cathelicidin, hcap-18, is processed to the antimicrobial peptide LL-37 by extracellular cleavage with proteinase 3. Blood. (2001) 97(12): Banaschewski, B. J. H. Antimicrobial and Biophysical Properties of Surfactant Supplemented with an Antimicrobial Peptide for Treatment of Bacterial Pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. (2015) 59, 4 Zhang, H, et al. Comparative study of clinical pulmonar surfactants using atomic force micorscopy. Biochimica et Biophsica Acta (2011) Malcharek, S., et al. Multilayer Structures in Lipid Monolayer Films Containing Surfactant Protein C: Effects of Cholesterol and POPE. Biophysis J.. Abril 2005, 88(4) VANDAMME, D. A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide. Cellular Immunology (2012). 280: Ouhara, K. Susceptibilities of periodontopathogenic and cariogenic bacteria to antibacterial peptides, β-defensins and LL37, produced by human epithelial cells. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55(6): , (2005). 8 - anetti. J. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. Journal of Leukocite Biology. (2004) 75(1): Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. (2002) 415 (6870): Estrada-López, E. D. Prednisolone adsorption on lung surfactant models: insights on the formation of nanoaggregates, monolayer collapse and prednisolone spreading. RSC Advances (2017) 7,
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