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NOTICE of CHANGE dated 18/03/16

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ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: NOTICE of CHANGE dated 18/03/16 IMPORTANT COMMUNICATION FOR THE USERS OF PRODUCT: ref. Following the new packaging of the kit, some changes were introduced in the Instruction for Use Manual (IFU) SCH m. - With the new packaging, the complete kit the product supplies only these components: «CMV AmpliMIX» and «CMV AmpliPROBE». When order ref. will be supplies olso following components: «Q - PCR Alert AmpliMASTER», «Q- CMV AmpliStandard» e «CPE - Internal Control» necessary for the assay. Detailed indications are reported in the enclosed Instructions for Use (IFU). The assay analytical principle and test reagents are unchanged. PLEASE NOTE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT Notice of Change SCH m dated 18/03/16 Pag. 1/1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: Ref. Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: (CMV. AmpliMIX) (CMV. AmpliPROBE) Q - PCR Alert AmpliMASTER -M (RTS015-MM) (RTS015-MP) RTS000 -M_Front 0344 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO KIT pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 3 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 4 OTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 4 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 4 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 6 PROCEDIMENTO pág. 7 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 15 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 16 BIBLIOGRAFIA pág. 23 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 24 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 25 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: Sítio WEB: -20 C O produto é um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e dosagem do DNA do Citomegalovírus humano (CMV) em amostras de DNA extraído do plasma colhido em EDTA, liquido amniótico, sangue total periférico colhido em EDTA, suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos. O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e no monitoramento da infecção de CMV. PRINCÍPIO DO TESTE O teste prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável incluído de sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para amplificação real time). Em cada pocinho se efectua uma reacção de amplificação específica para uma região do gene MIEA de CMV e para uma região do gene humano da beta-globina (Controlo Interno de inibição) utilizando o DNA extraído das amostras em exame. A sonda específica para CMV marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para CMV. A sonda específica para o Controlo Interno marcada com o fluoróforo VIC é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o Controlo Interno. A emissão da fluorescência aumenta com o aumentar dos produtos específicos da reacção de amplificação e é medida e registrada pelo equipamento. A elaboração dos dados permitem determinar a presença e a titulação do DNA de CMV na amostra de partida. A validação do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems da série DESCRIÇÃO DO KIT O kit completo fornece os seguintes componentes. CMV AmpliMIX Uma mistura de oligonucleotídeos primers para amplificação real time numa solução estabilizada, previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. Cada oligonucleotídeos de primers para CMV são específicos para uma região do exon 4 do gene MIEA de CMV (major immediate early antigen, HCMVUL123). Os oligonucleotídeos de primers para o Controlo Interno de inibição são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano da beta-globina. CMV AmpliPROBE Uma mistura de sondas fluorescentes para amplificação real time numa solução estabilizada, previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. A sonda para CMV é marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada pelo grupo MGB -NFQ. A sonda para CMV é específica para uma região do exon 4 do gene MIEA de CMV. A sonda para o Controlo Interno de inibição é marcada com o fluoróforo VIC e bloqueada pelo grupo MGB -NFQ. As sondas para o controlo interno de inibição específica para as regiões promotoras e 5' UTR do gene humano da beta-globina. O kit permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO KIT Componente Descrição Quantidade Classificação e etiquetagem CMV AmpliMIX CMV AmpliPROBE mistura de oligonucleotídeos primers Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB-NFQ e com VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl - 4 x 110 µl - SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 1 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 2 / 25 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em látex ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água bidestilada estéril. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência Applied Biosystems da série 7000, calibrado como previsto pelo fabricante. OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, el control positivo de extracción, os reagentes optimizados para a amplificação e el DNA standard a quantidade reconhecida não estão incluídos neste kit. Para a extracção manual do DNA das amostras celulares, recomenda-se o uso do produto genérico «EXTRAcell» (ELITechGroup S.p.A., código EXTD02), kit de extracção do DNA de amostras celulares. Para a extracção manual do DNA das amostras celulares, recomenda-se o uso do produto genérico «EXTRAgen» (ELITechGroup S.p.A., código EXTG01), kit de extracção dos ácidos nucleicos de amostras não celulares. Para a extracção automática do DNA das amostras celulares, recomenda-se a utilização dos produtos genéricos «NucliSENS easymag Reagents» (biomérieux SA, códigos , , , , , ), kit de extracção dos ácidos nucleicos de amostras biológicas, com o instrumento «NucliSENS easymag» (biomérieux SA, código ). Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, aconselha-se a utilização do produto genérico Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, aconselha-se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com poços de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. «CPE - Internal Control» (ELITechGroup S.p.A., código CTRCPE), controlo positivo de extracção, uma solução estabilizada contendo dois DNA plasmídico e RNA genómico de fago MS2 para sistemas de extracção do RNA a partir de amostras biológicas celulares e não celular. «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (ELITechGroup S.p.A., código RTS000), mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time e a determinação alélica. No caso em que seja solicitado um resultado quantitativo da análise (dosagem do DNA de CMV) «CMV tr. Q - PCR Standard» (ELITechGroup S.p.A., código STD015), DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler atentamente todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não utilizar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal competente e instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e equipamentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e equipamentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados numa única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes Os tubos que contenham o AmpliMIX e o AmpliPROBE são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção. SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 3 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 4 / 25 Amostras AMOSTRAS E CONTROLOS Este produto deve ser utilizado com as seguintes amostras biológicas: Plasma colhido em EDTA, liquido amniótico, sangue total periférico colhido em EDTA, suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos. Plasma colhido em EDTA As amostras de plasma destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas, em caso contrário devem ser congeladas e conservadas a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Para uma óptima conservação das amostras aconselha-se subdividí-las (volume mínimo 300 µl) e de conservá-las congeladas a -20ºC por um período máximo de 30 dias ou ainda a -20ºC por um período mais longo. Evitar submeter as amostras a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Quando se utilizam amostras congeladas, proceder ao descongelamento imediato, antes do início da extracção para evitar fenómenos de degradação dos ácidos nucléicos. Acrescentar 5 µl de CPE às amostras de plasma para o controlo interno antes de extrair o DNA como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAgen». Liquido amniótico As amostras de liquido amniótico destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas, em caso contrário devem ser congeladas e conservadas a -20ºC por um máximo de trinta dias ou ainda a -70ºC por um maior tempo. Para uma óptima conservação das amostras aconselha-se subdividí-las em mais aliquotas (volume mínimo 300 µl). Evitar submeter as amostras a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Quando se utilizam amostras congeladas, proceder ao descongelamento imediato, antes do início da extracção para evitar fenómenos de degradação dos ácidos nucléicos. Acrescentar 5 µl de CPE às amostras de liquido amniótico para o controlo interno antes de extrair o DNA como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAgen». Sangue total periférico colhido em EDTA As amostras de sangue total periférico destinados à extracção do DNA devem ser colhidas em EDTA segundo as indicações do laboratório, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de três dias. Não congelar as amostras de sangue total periférico para evitar a lysine das células e a perda da titulação viral. Nota: quando se realiza a extracção manual do DNA com o kit «EXTRAcell», as amostras de Sangue total periférico devem ser pré-tratadas e o DNA deve ser extraído como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell». Nota: quando se realiza a extracção do DNA com o instrumento «NucliSENS easymag», utilize o protocolo de extracção Generic e siga estas indicações: coloque 100 µl de amostra na Strip de 8 poços, carregue a Strip no instrumento e inicie a extracção sem incubação para a lise; depois que o instrumento adicionou o EasyMAG Lysis Buffer, misture directamente no instrumento por três vezes o conteúdo da Strip com a pipeta multicanal fornecida, usando o programa 3; deixe incubar por 10 minutos e então adicione o EasyMAG Magnetic Silica ao conteúdo da Strip com a pipeta multicanal e o programa 3; prossiga com a extracção; recupere o DNA com 55 µl de tampão de eluição. Substâncias interferentes As amostras de plasma e de sangue total periférico não devem conter heparina. A heparina é um potente inibidor da DNA polimerase. As amostras de plasma, as suspensões de leucócitos e as suspensões de granulócitos não devem conter Ficoll, dextrano ou Hemoglobina. Estas substâncias podem causar a inibição da DNA polimerase. A quantidade de DNA genómico humano elevadas no DNA extraído da amostra podem inibir a reacção de amplificação. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos anti-virais, como Ganciclovir o Foscarnet, quimioterápicos ou imunosupressores. Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção de controlo negativo e uma reacção de controlo positivo. Para o controlo negativo utilizar 5 µl de água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controlo positivo utilizar 5 µl de AmpliSTANDARD, como descrito na secção seguinte. Controlos de qualidade É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado. PROCEDIMENTO Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Caso se utilize um instrumento 7300 Real-Time PCR System: Antes de iniciar a sessão referindo-se à documentação do equipamento é necessário: - ligar o thermal - cycler para real time, ligar o computer de controlo, iniciar o software apropriado e abrir uma sessão absolute quantitation ; - programar (Detector Manager) o detector para a sonda para CMV com o reporter = FAM e o quencher = none (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo CMV ; - programar (Detector Manager) o detector para a sonda para o Controlo Interno com o reporter = VIC e o quencher = none (NFQ é um quencher não fluorescente) e chamá-lo CI ; - para qualquer pocinho em uso da microplaca, programar (Well Inspector) o detector (tipo de fluorescência para medir), o passive reference = ROX (normalização da fluorescência medida) e o tipo de reacção (amostra, controlo negativo de amplificação, controlo positivo de amplificação, standard com a relativa quantidade reconhecida). Compilar o Plano de trabalho anexado ao final deste manual de instruções para o uso transcrevendo estas informações ou imprimir a organização da microplaca. O Plano de trabalho deverá ser seguido com atenção durante a transferência nos poços da mistura de reacção e das amostras. Nota: para a determinação da titulação do DNA nas amostras de partida é necessário preparar uma série de reacções com o DNA standard a quantidade reconhecida (10 5 cópias, 10 4 cópias, 10 3 cópias, 10 2 cópias) para obter a Curva standard. Suspensões de leucócitos e suspensões de granulócitos As amostras de leucócitos e as amostras de granulócitos destinadas à extracção do DNA devem ser preparadas segundo as indicações do laboratório, suspendidas em Solução fisiológica estéril ou PBS estéril, contadas e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de quatro horas. Não congelar as suspensões de leucócitos e as suspensões de granulócitos para evitar a lysine das células e a perda da titulação viral. O DNA deve ser extraído das suspensões de leucócitos e das suspensões de granulócitos como referido no Manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell». SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 5 / 25 SCH m_pt 27/03/15 Revisão 08 Pág. 6 / 25 Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise quantitativa de 12 amostras. C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 CN Significado: C1 - C12: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; 10 2 : Standard 10 2 cópias; 10 3 : Standard 10 3 cópias; 10 4 : Standard 10 4 cópias; 10 5 : Standard 10 5 cópias. - Referindo-se à documentação do equipamento, programar no thermal cycler (Instrument Thermal Cycler Protocol Thermal Profile) os parâmetros do ciclo térmico indicando 45 ciclos e um volume de reacção de 25 µl e, se possível, escolher a opção 9600 emulation . Ciclo térmico de amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 mín. Desnaturação inicial 95 C 10 mín. 45 ciclos 95 C 15 seg. 60 C 1 mín. Caso se utilize um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument: Antes de iniciar a sessão, referindo-se à documentação do equipame
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