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POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA

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POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS ATIVADOS POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS
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POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS ATIVADOS POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS DE TEMPO Livros Grátis Milhares de livros grátis para download. POLYANA DAS GRAÇAS FIGUEIREDO VILELA AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE METALOPROTEINASES DA MATRIZ (MMP-3 E MMP-8) POR MACRÓFAGOS ATIVADOS POR DIFERENTES CONCENTRAÇÕES DE ENDOTOXINAS (LPS) EM VARIADOS PERÍODOS DE TEMPO Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE, pelo Programa de Pós-graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área Microbiologia / Imunologia. Orientador: Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge Co-orientador: Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira São José dos Campos 2009 Apresentação gráfica e normalização de acordo com: Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; V618a Vilela, Polyana das Graças Figueiredo. Avaliação da liberação de metaloproteinases da matriz (MMP-3 e MMP-8) por macrófagos ativados por diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) em variados períodos de tempo / Polyana das Graças Figueiredo Vilela. São José dos Campos : [s.n.], f. : il. Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,Universidade Estadual Paulista, Orientador: Prof. Dr. Antonio Olavo Cardoso Jorge 1. Metaloproteinases da Matriz. 2. Endotoxinas. 3. Macrófagos. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título Ficha catalográfica elaborada pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos UNESP td24 AUTORIZAÇÃO Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte. São José dos Campos, 20 de Agosto de Assinatura : BANCA EXAMINADORA Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge (Orientador) Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito Faculdade de Odontologia de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP Profa. Dra. Mariella Vieira Pereira Leão Instituto Básico de Biociências Universidade de Taubaté - UNITAU São José dos Campos, 23 de Julho de 2009. DEDICATÓRIA A meu pai e minha mãe do céu, por abençoarem cada dia de minha vida. Aos meus amados pais, Dércio Afonso Maria Vilela e Celma Figueiredo Vilela. Vocês são meus maiores exemplos de dignidade, bom caráter, perseverança, responsabilidade, sabedoria, força e humildade. Obrigada por tudo que fazem por mim. Minha família é o maior presente que Deus me deu. À minha amada irmã Luciana Figueiredo Vilela, por ser minha eterna e grande amiga. Por estar sempre ao meu lado, me dando um pouco de sua força e sabedoria. Aos meus queridos sobrinhos Álvaro, João Pedro e Luís Henrique e ao meu afilhado Luan, por nos darem o prazer e a alegria da convivência. Ao Eder, por seu amor, seu companheirismo, sua paciência e por todos os momentos simples e felizes que tivemos. Sua presença neste momento foi muito importante. A todos de minha grande e maravilhosa família, que mesmo longe estão presentes em minha vida. AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, na pessoa do diretor da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Prof. Adj. José Roberto Rodrigues e do vice-diretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli. Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, na coordenação da Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito e Profa. Adj. Rosilene Fernandes da Rocha. Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal. Às secretárias da Seção de Pós-Graduação Rosemary de Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria Aparecida Consíglio de Souza, pelos auxílios prestados. À Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de mestrado (Processo 2007/ ) e do Auxílio à Pesquisa (Processo 2008/ ) que possibilitaram a realização deste trabalho. Ao Prof. Tit. Antonio Olavo Cardoso Jorge, pelo conhecimento compartilhado, pelo apoio, pela confiança e por suas sábias considerações. Seu senso de justiça, equilíbrio, sabedoria e ponderação são marcantes e admiráveis. À Profa. Dra. Luciane Dias de Oliveira. Agradeço especialmente e muito carinhosamente por sua amizade, compreensão, paciência, preocupação, dedicação, por suas orações, seu carinho, seus ensinamentos científicos e pessoais e pelo apoio de sempre. À Profa. Adj. Cristiane Yumi Koga Ito. Muito obrigada por sua amizade, seu apoio, ensinamento, carinho, preocupação e disposição em todos os momentos, principalmente nos mais difíceis. À Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira, pelo convívio fraterno e pelos ensinamentos compartilhados. À minha querida amiga Emanuele Gonçalves Brito, que muito me ajudou e ensinou neste ano. Muito brigada por tudo que fez por mim. Aos amigos da Pós-graduação, Rogério de Lima Romeiro, Pietro Mainenti, Joyce da Silva Martins, Bruno Mello de Matos, Alessandra Sverberi Carvalho, Marta Majewski, Rosilene Batista de Aguiar Almeida, Flávio Pires Molina, Ana Carolina Salvia, Daniel Freitas Alves Pereira, Ana Paula de Lima, Karina Bortolin Lodi e Mary Anne Moreira Bárbara pelo convívio fraterno e pelas parcerias, em especial agradeço Cristiane Aparecida Pereira, Fernanda Lourenção Brighenti, Graziella Nuremberg Back Brito, Simone Vilela e Guilherme Rodrigues Teodoro, que me deram apoio em todos os momentos. Muito obrigada pelo carinho, pela amizade e preocupação nos momentos difíceis. Ao Sérgio Giovanny Alves, Domingos Gonçalves Pontes e Ana Paula Simão Correa Matos, pela convivência e por tudo que fazem por nós da Pós-graduação. A Sílvia Scarpel e Carlos Guedes, pelos auxílios prestados. Ao Prof. Dr. Josemar Parreira Guimarães, por apoiar e incentivar meu crescimento na área acadêmica e de pesquisa. A toda equipe do COAT, em especial Prof. Wagner de Oliveira, Profa. Marta Rampani, pelo apoio e pela convivência enriquecedora e agradável. Aos amigos José Márcio Nacur de Almeida e Aldo Ivan Pereira Paiva e às amigas Patrícia Almeida Grunewald, Aneíse Gomes de Moura, Liliam Gazolla, Ana Carolina Nogueira, Patrícia Reis, Luciana Caetano, Michele Cardoso, Ana Paula Ferreira, Isabela Oliveira, Gleyce Oliveira Silva, que mesmo longe ou perto sempre me deram apoio. À Lívia Maria Serpa Gregorio, Lo Ruana Pereira de Freitas e Lígia Tiaki Yamamoto, pela convivência fraterna. Tão misericordioso é Deus, que nos dá oportunidade de corrigir erros, começar de novo, fazer o dia de hoje melhor que o dia de ontem. R. O. Dantas SUMÁRIO RESUMO LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS INTRODUÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e periapicais Envolvimento das metaloproteinases da matriz (MMP) nas alterações pulpares e periapicais PROPOSIÇÃO MATERIAL E MÉTODO Cultura celular Diferenciação celular Viabilidade da cultura de células Endotoxinas (LPS) Ativação celular pela endotoxina (LPS) Análise da liberação de metaloproteinases da matriz extracelular (MMP-3 e MMP-8) pelos monócitos/macrófagos (U937) RESULTADOS Produção de MMP Produção de MMP DISCUSSÃO Da metodologia Dos resultados CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 63 ANEXO ABSTRACT... 74 Vilela PGF. Avaliação da liberação de metaloproteinases da matriz (MMP- 3 e MMP-8) por macrófagos ativados por diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) em variados períodos de tempo [dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; RESUMO A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP- 3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p 0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados. Palavras-chave: metaloproteinases da matriz; endotoxinas; macrófagos. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMPc = Adenosina Monofosfato Cíclico CMT = Tetraciclina Quimicamente Modificada COX = Cicloxigenase cpla 2 = Fosfolipase A 2 citosólica DO = Densidade Óptica ELISA = Ensaio Imunossorbente Ligado à Enzima EU = Unidade de Endotoxina FGF = Fator de Crescimento para Fibroblatos IL = Interleucina ICAM 1 = Molécula de Adesão Intercelular-1 LPS = Lipopolissacarídeo MEC = Matriz Extracelular MMP = Metaloproteinase da Matriz MT-MMP = Metaloproteinase ligada à Membrana Plasmática NO = Óxido Nítrico (O - 2 ) = Superóxido PDGF = Fator de Crescimento Plaquetário PGE 2 = Prostaglandina E 2 PMA = Phorbol-12-myristate-13-acetate PMN = Polimorfonuclear Neutrófilo RNAm = Ácido Ribonucléico mensageiro TIMP = Inibidor de Metaloproteinase Tecidual TNF = Fator de Necrose Tumoral TGF = Fator de Crescimento e Transformação VCAM 1 = Molécula de Adesão Celular Vascular-1 1 INTRODUÇÃO Microrganismos e seus produtos são os principais responsáveis pela indução e manutenção das alterações pulpares e periapicais, promovendo reação inflamatória e reabsorção óssea periapical (Hong et al., 2004). A inflamação pulpar geralmente é causada por uma extensão da cárie dentária, permitindo que as células da polpa entrem em contato com bactérias ou seus produtos, o que pode resultar em pulpite (Hahn; Liewehr, 2007; Lee et al., 2008). Em dentes com necrose pulpar e periodontite apical, a infecção é causada por combinações específicas de bactérias anaeróbias facultativas e estritas, principalmente Gram-negativas (Sundqvist et al., 1989). O principal fator de virulência das bactérias Gramnegativas é representado pela liberação de endotoxinas, que são complexos lipopolissacarídicos presentes na membrana externa da parede celular bacteriana (Petsch; Anspach, 2000). O acúmulo destes componentes bacterianos na polpa dentária ou na região periapical pode estimular macrófagos presentes na área a produzirem citocinas. A secreção de citocinas pode estimular as células da polpa a produzirem enzimas que degradam a matriz extracelular (Panagakos et al., 1996). Desta forma, as bactérias Gram-negativas têm papel central na inflamação pulpar e periapical (Lee et al., 2008). Durante a inflamação periapical, as células residentes do tecido periapical liberam vários mediadores inflamatórios, citocinas próinflamatórias e fatores de crescimento por meio de resposta imune inata e adaptativa (Lin et al., 2007; Carneiro et al., 2009). Citocinas como IL-1 e TNF- são potentes estimuladores da reabsorção óssea. Um dos mecanismos pelos quais estas citocinas induzem reabsorção é por meio 13 da estimulação da produção e secreção de metaloproteinases da matriz (MMP) pelas células presentes no local da inflamação (O Boskey; Panagakos, 1998). Em 1997, Wang et al. demonstraram em modelo experimental de reabsorção óssea em ratos, que IL-1 e TNF- são importantes mediadores da reabsorção óssea na patogênese da lesão. Entretanto, existe pouca informação sobre o efeito das citocinas e do LPS na produção de MMP por células da polpa in vitro (Panagakos et al., 1996) e o mecanismo patológico preciso, envolvido na lesão periapical, ainda não está totalmente esclarecido (Takahashi, 1998). Estudos relataram que a inoculação de LPS no interior dos canais radiculares de cães produziu reação inflamatória e reabsorção óssea periapical (Nelson-Filho et al., 2002; Silva et al., 2002), demonstrando a correlação positiva entre endotoxinas e presença de lesões periapicais (Sundqvist, 1992). Hong et al. (2004) sugeriram que a presença de endotoxinas em canais radiculares infectados estimula macrófagos a liberar IL-1 e TNF-, as quais induzem a síntese de metaloproteinase da matriz (MMP-1) e, conseqüentemente, reabsorção óssea periapical. De acordo com os autores, IL-1 e TNF- apresentam papel significante na patogênese das alterações pulpares e periapicais. Os autores verificaram ainda, em modelo experimental de lesão periapical em ratos, que a administração de polimixina B (antibiótico catiônico com potente atividade sobre LPS) reduziu a extensão das lesões em 76% a 80% e, simultaneamente, reduziu o número de macrófagos produtores de MMP-1. As metaloproteinases da matriz são uma família de enzimas estruturalmente relacionadas, mas geneticamente distintas, que degradam componentes da matriz extracelular (Sorsa et al., 2004) e estão envolvidas com a remodelação fisiológica e patológica do tecido (Krane, 1994; Lin et al., 2001). Este grupo de 23 enzimas humanas é classificado em colagenases (MMP-1, 8 e 13), gelatinases (MMP-2 e 9), 14 estromelisinas (MMP-3, 7, 10, 11 e 12), enamelisina (MMP-20) e MMPs ligadas à membrana plasmática (MT-MMP), entre outras (Llano et al., 1997; Tjäderhane et al., 2001). O conhecimento detalhado das MMP é importante para o entendimento da patogênese da inflamação pulpar e periapical (Tsai et al., 2005). As MMP são produzidas por diversos tipos de células incluindo neutrófilos, fibroblastos e macrófagos (Kumar et al., 2005) e sua atividade é controlada por alterações no delicado balanço entre a expressão e síntese das MMP e seus principais inibidores endógenos (Sorsa et al., 2004). A produção das MMP e dos inibidores de metaloproteinases teciduais (TIMP) pelas células é regulado por muitas citocinas, fatores de crescimento e hormônios. O desequilíbrio entre MMP e TIMP pode influenciar o processo de destruição tecidual (Takahashi, 1998). Assim como em outros tecidos com inflamação, as MMP estão presentes no tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais (Wahlgren et al., 2002). Entretanto, os dados sobre a presença e função das MMP nos tecidos dentários são limitados (Tjäderhane et al., 2001). De acordo com Takahashi (1998), são necessários mais estudos para determinar o mecanismo regulatório de MMP e TIMP nas lesões periapicais. Em 2001, Lin et al. sugeriram que a expressão gênica de MMP-1 e TIMP-1, estimulada por citocinas em fibroblastos da polpa, é mediada, em parte, por uma via dependente de prostaglandina. Outros autores têm demonstrado que a prostaglandina E 2 (PGE 2 ) tem sido relatada como sinérgica ou antagônica com IL-1 ou TNF- na modulação da expressão de MMP-1 e TIMP-1, dependendo do tipo de célula (Takahashi et al., 1997; Zhang et al., 1998). Lin et al. (2002) relataram que macrófagos e osteoblastos estão envolvidos no desenvolvimento de lesões periapicais e que promovem reabsorção óssea pela produção de MMP-1, IL-6 e cicloxigenase-2 (COX-2). Em 2003, Lin et al. relataram que a participação 15 de diferentes citocinas em estimular a secreção de MMP envolvidas nas alterações da polpa e periápice ainda não está bem esclarecida. Shin et al. (2002) detectaram MMP-1, MMP-2 e MMP-3 em tecido pulpar inflamado e em lesões periapicais, sugerindo que as MMP têm importante papel na inflamação pulpar e periapical, especialmente em pulpites sintomáticas, o que poderia estar relacionado com o aumento do nível de prostaglandina E 2 (PGE 2 ) nestas situações. No entanto, esta interação entre MMP e prostaglandina em macrófagos deve ser melhor estudada. As células do infiltrado inflamatório são as principais produtoras de MMP, e o efeito parácrino e autócrino do repertório de citocinas destas células inflamatórias é, provavelmente, o que causa o desequilíbrio na proporção entre MMP e TIMP, levando, por fim, à alteração da arquitetura da matriz extracelular (Kim et al., 2006). Em 2007, Bodet et al. avaliaram a produção de MMP e de seus inibidores (TIMP) por fibroblastos gengivais estimulados por LPS de Actinobacillus actinomycetemcomitans e verificaram que LPS pode estimular a produção de MMP-2, MMP-3 e TIMP-1 e a atividade das MMP. É provável também que o aumento da expressão de TIMP não compense o aumento da expressão de MMP, causando um desequilíbrio na relação MMP/TIMP, o que pode contribuir para destruição do tecido conjuntivo periodontal. LPS é um potente ativador de monócitos/macrófagos e pode, portanto, induzir a produção de diversos mediadores e citocinas (Tanabe; Grenier, 2008) como TNF-, IL-1β, PGE 2 (Bodet et al., 2006; Lee et al., 2007) e IL-1α (Hong et al., 2004), além de possuir importante papel na maturação de células progenitoras de osteoclastos e na perda óssea (Islam et al., 2007). No entanto, o real papel do LPS na indução e manutenção da reabsorção óssea periapical ainda não está totalmente esclarecido, de modo que sua participação na liberação de citocinas e, conseqüentemente, de diferentes metaloproteinases da matriz 16 extracelular poderia esclarecer melhor os efeitos do LPS na patogênese das alterações pulpares e periapicais e os principais fatores envolvidos neste processo. 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Endotoxina (LPS): participação nas alterações pulpares e periapicais A partir da década de 80, os avanços tecnológicos na cultura e identificação microbiológica demonstraram que, em canais radiculares de dentes com necrose pulpar e lesão periapical crônica, predominavam microrganismos anaeróbios, principalmente Gramnegativos (Leonardo et al., 2004). Quando a polpa dentária é exposta à cavidade bucal, ocorre contaminação inicial, predominantemente, de microrganismos aeróbios e facultativos. À medida que o processo infeccioso progride, o decréscimo de oxigênio e o desenvolvimento de um baixo potencial de óxido-redução favorecem a mudança desta microbiota que passa a ser, predominantemente, de microrganismos anaeróbios (Sundqvist; Sweden, 1994). Tani-Ishii et al., em 1994, verificaram que na fase ativa de destruição óssea periapical e expansão das lesões em ratos, havia predomínio de bactérias anaeróbias estritas Gram-negativas. Os microrganismos Gram-negativos, além de possuírem diferentes fatores de virulência e gerarem produtos e subprodutos tóxicos aos tecidos apicais e periapicais, contêm lipopolissacarídeo (LPS) na membrana externa de sua parede celular. O LPS, que tem atividade de endotoxina, é liberado quando há multiplicação ou morte bacteriana, desencadeando uma série de efeitos biológicos, que levam a uma reação inflamatória e à reabsorção dos tecidos mineralizados (Nelson-Filho et al., 2002; Leonardo et al., 2004), desempenhando importante papel na indução e manutenção das lesões periapicais (Jiang et al., 2006). 18 Segundo Takahashi (1998), os possíveis mecanismos patológicos da lesão periapical precisam ser discutidos, uma vez que, o mecanismo preciso envolvido nesta lesão ainda não está totalmente esclarecido. Existem poucos estudos que avaliaram, isoladamente, o efeito do LPS no tecido apical e periapical (Silva et al., 2002) e a relação entre LPS e o desenvolvimento de lesão periapical com concomitante reabsorção óssea, permanece controversa (Hong et al., 2004). Lee et al. (2008) examinara
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