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TAMARA ESTEVES FERREIRA. ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt)

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TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) SETE LAGOAS MG 2014 TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE
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TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) SETE LAGOAS MG 2014 TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) SETE LAGOAS/MG 2014 TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Agrárias da Universidade Federal de São João Del Rei, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Agrárias. Orientador: Prof. Dr.Marcos Antônio Matiello Fadini Coorientador: Dr. Ivan Cruz Coorientadora: Profa. Dr. Cidália Gabriela Santos Marinho SETE LAGOAS/MG 2014 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Divisão de Biblioteca da UFSJ, MG, Brasil. F368a 2014 Ferreira, Tamara Esteves, Ácaros fitofagos em milho geneticamente modificado com o gene do Bacillus thuringiensis (Bt) / Tamara Esteves Ferreira f. : il. Orientador: Marcos Antônio Matiello Fadini Co-orientadores: Ivan Cruz Cidália Gabriela Santos Marinho Dissertação (mestrado) Universidade Federal de São João Del-Rei, Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias. Inclui bibliografia. 1. Milho - Cultivo - Teses. 2. Milho - Melhoramento genético - Teses. 3. Milho - Proteína Bt - Teses. I. Fadini, Marcos Antônio Matiello. II. Cruz, Ivan. III. Marinho, Cidália Gabriela Santos. IV. Universidade Federal de São João Del-Rei. Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias. V. Título. CDU: 63 TAMARA ESTEVES FERREIRA ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Agrárias da Universidade Federal de São João Del Rei, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Ciências Agrárias. Orientador: Prof. Dr.Marcos Antônio Matiello Fadini Coorientador: Dr. Ivan Cruz Coorientadora: Profa. Dr. Cidália Gabriela Santos Marinho Sete Lagoas, 25 de fevereiro de Banca examinadora: Dra. Simone Martins Mendes- Embrapa- CNPMS Prof. Dr. Marco Antônio Alves Carneiro- UFOP Orientador: Prof. Dr. Marcos Antônio Matiello Fadini-UFSJ DEDICATÓRIA Aos meus pais Geraldo e Eunice, ouro de mina, por todo amor, incentivo e confiança, aos meus irmãos Thaís e Marcos, pelo apoio meus maiores exemplos, ao meu amado Phelippe, pelo companheirismo e apoio. Dedico e Agradeço. AGRADECIMENTOS Deus pelo Dom da vida, e por me permitir concluir mais uma etapa em minha caminhada. Ao Prof. Dr. Marcos Antônio Matiello Fadini pela orientação, ensinamento, dedicação, amizade, pelo conhecimento transmitido e distinto exemplo que contribuiu para o meu desenvolvimento profissional. Aos meus pais Geraldo Henrique Ferreira e Eunice de Fátima Esteves Ferreira, pelo amor, respeito, ensinamento e compreensão que tiveram para que eu pudesse chegar até aqui. Aos meus irmãos Thais Cristina Ferreira e Marcos Paulo Ferreira por amarem. Ao meu amado Phelippe Passini Silva, pelo amor, atenção, companheirismo, por me dar força para continuar, por toda paciência, por acreditar em mim e simplesmente por existir em minha vida. À UFSJ pela oportunidade da realização do mestrado. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias, pelos ensinamentos e apoio em especial ao Prof. Dr. Ernani Clarete e Prof. Dra. Wânia Neves pela amizade. Ao Dr. Ivan Cruz pela amizade e por despertar e incentivar meu gosto pela entomologia. Aos amigos do Lacri (Laboratório de Criação de Inseto- Embrapa Milho e Sorgo, pela amizade, em especial ao Rafael por confiar e ajudar na graduação e mestrado, aos técnicos, Geraldo, Zaza, Taquinho e Márcio. À Dra. Simone pela ajuda, durante todo o desenvolvimento do experimento. Aos técnicos do laboratório da Embrapa Milho e Sorgo, Ismael, Carlinho, Célio e Adenilson, por toda ajuda na realização dos experimentos. À Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Milho e Sorgo, pela disponibilização de toda a infra-estrutura para que o projeto pudesse ser realizado; Aos meus coorientadores Dr. Ivan Cruz e Profa. Cidália Gabriela Santos Marinho, pela orientação e amizade. Aos Professores Dra. Simone Martins Mendes, Dr. Marco Antônio Alves Carneiro, Dr. Anderson Oliveira Latini por aceitarem fazer parte da banca examinadora desta dissertação. Aos amigos de turma Alexandre, Deniete, Fernando Tinoco e Mayara, pelos bons momentos, em especial à Denize e Crísia pela amizade verdadeira e apoio. Aos amigos do Laboratório de Entomologia da UFSJ, Valéria, Paula, Pedro, André, pela ajuda e risadas. À todos meus familiares pelo apoio. À todos os velhos e bons amigos que contribuíram para o meu crescimento pessoal. À Fapemig, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, pela concessão da bolsa de mestrado. Enfim a todos que contribuíram direta ou indiretamente para que eu pudesse realizar mais este sonho. Muito Obrigada SUMÁRIO RESUMO...i ABSTRACT...ii 1.INTRODUÇÃO GERAL REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Artigo 1: Respostas de Ácaros fitófagos como modelo de Organismo não alvo em Milho Bt RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS Artigo 2: Preferência Alimentar e Crescimento Populacional Tetranycus urticae (Acari: Tetranychidae) em Milho Bt RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAL E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS CONCLUSÕES GERAIS...42 ÁCAROS FITÓFAGOS EM MILHO GENETICAMENTE MODIFICADO COM O GENE DO Bacillus thuringiensis (Bt) RESUMO - Com a crescente utilização de cultivares transgênicas de milho com o gene bt, organizações internacionais tem solicitado o estudo de impactos ambientais dessa tecnologia sobre solo, fauna e flora nativa. O estudo de organismos não-alvo, como ácaros, pode fornecer informações sobre os possíveis efeitos do uso de cultivares transgênicas de milho sobre o agroecossistema. A presente dissertação tem como objetivos (i) Avaliar a abundância de espécies de ácaros fitófagos em área de milho Bt e não Bt; (ii) Avaliar a taxa instantânea de crescimento e preferência alimentar de ácaros fitófagos entre plantas de milho Bt e não Bt. Espera-se que, com o desenvolvimento da presente dissertação possamse: atender tanto demandas aplicadas de otimização do manejo integrado de pragas do milho com o uso de milho geneticamente modificado com o gene bt, quanto avançar nas fronteiras do conhecimento sobre o papel de defesas de planta sobre a estruturação e riqueza de espécies de artrópodes em teias alimentares em agroecosssitemas. Nos testes de abundância foram encontrados 2403 e 93 indivíduos das espécies Catarhinus tricholaenae e Aceria zeala, respectivamente. Os cultivares de milho Bt (30F35 Hx, 30F35 Yg e Impacto Viptera) não afetaram significativamente o número médio de ácaros C. tricholaenae e A. zeala em relação a cultivar convencional. Ao avaliar a taxa instantânea de crescimento e preferência. A taxa instantânea de crescimento populacional (ri) para T. urticae não diferiu entre as fêmeas. Fêmeas de T. urticae não apresentaram preferência entre as faces foliares das cultivares 30F35 Hx vs 30F35 Convencional; 30F35 Yg vs 30F35 Convencional e Impacto Viptera vs 30F35 Convencional, às 24 horas após a liberação, quanto às 48 horas de observação. A Proteína Cry presente nas variedades de milho Bt não afeta na abundância, a taxa instantânea de crescimento populacional e preferência alimentar de ácaros fitófagos. Palavras-chave: Acari, organismos geneticamante modificados, defesa de plantas,proteína Bt, organismos não-alvo i Comitê Orientador: Prof. Dr. Marcos Antônio Matiello Fadini UFSJ (Orientador); Dr. Ivan Cruz (Coorientador)- Embrapa-CNPMS; Profa. Dra. Cidália Gabriela Santos Marinho (Coorientadora)- UFSJ. PHYTOPHAGOUS MITES ON MAIZE GENETICALLY MODIFIED WITH Bacillus thuringiensis (Bt) GENE ABSTRACT- With the increasing use of transgenic maize cultivars with the bt gene, international organizations have called for environmental impact studies of this technology on soil, native flora and fauna. The study of non-target organisms such as mites, can provide information on the possible effects of transgenic maize crops on agroecosystems. The present dissertation aims to (i) assess the abundance of phytophagous mites in a Bt and non-bt area; (ii) evaluate the instantaneous growth rate and food preference of phytophagous mites between Bt and non-bt maize. It is hoped that the development of this dissertation can: meet the demands applied to optimize the maize integrated pest management with the use of maize genetically modified with the bt gene, as well as advance the frontiers of knowledge on the role of plant defenses on structure and species richness of arthropods in agroecosystems food webs. In abundance tests, 2403 and 93 individuals of the species Catarhinus tricholaenae and Aceria zeala, respectively, were found. The Bt maize cultivars (30F35 Hx, 30F35 Yg and Impacto Viptera) did not significantly affect the average number of C. tricholaenae and A. zeala mites compared to the conventional cultivar. When evaluating the instantaneous rate of growth and feeding preference the instantaneous rate of population growth (ri) for T. urticae did not differ among females. Females of T. urticae showed no preference between the leaf surfaces of cultivars 30F35 Hx vs 30F35 Conventional; 30F35 Yg vs Conventional 30F35 and Impacto Viptera vs 30F35 Conventional at 24 hours after release, regarding the 48-hours of observation. The Cry protein present in Bt maize varieties does not affect the abundance, the instantaneous rate of population growth and food preference of phytophagous mites. Keywords: Acari, geneticamante modified organisms, plant defense, Bt protein, non-target organisms ii Guidance Committee: Prof. Dr. Marcos Antônio Matiello Fadini UFSJ (Advisor); Dr. Ivan Cruz (Coadvisor)- Embrapa-CNPMS; Profa. Dra. Cidália Gabriela Santos Marinho (Coadvisor)- UFSJ. 1. INTRODUÇÃO As plantas se protegem contra fitófagos por meio de defesas constitutivas e induzidas, que reduzem a ação dos fitófagos. Nas defesas constitutivas, a planta expressa resistência de forma contínua e não depende da presença ou ação de fitófagos, enquanto que nas defesas induzidas, as defesas se expressam somente após a injúria, podendo atuar direta ou indiretamente sobre os fitófagos (Price et al., 1980). Nas defesas constitutivas, as plantas podem desenvolver características estruturais que atuam, por exemplo, como uma barreira mecânica, proporcionando dureza e rigidez, dificultando a locomoção e a alimentação pelo fitófago. Nestas, estão inclusas estruturas como tricomas, depósitos cuticulares, maior espessura da epiderme, a abundância de cristais, fibras e a disposição destas estruturas e tecidos na folha, dentre outras (Becerra, 1994). As defesas induzidas ocorrem em resposta ao ataque dos fitófagos, caracterizadas pelo incremento em metabólicos secundários ou proteínas associadas à defesa, que afetam diretamente os fitófagos, ou indiretamente, atraindo inimigos naturais de tais fitófagos mediante a liberação de voláteis (Ament et al., 2004). As emissões de voláteis têm sido reportadas para algumas espécies de plantas (Fadini et al., 2010) e estão envolvidas nas interações tróficas entre plantas e insetos, principalmente, entre lagartas e plantas, ácaros fitófagos e ácaros predadores (Dicke et al., 2000). O estudo das defesas de plantas é básico para o desenvolvimento de métodos de controle de pragas por meio de resistência em sistemas agrícolas e dentre as defesas constitutivas de plantas se encontram as plantas geneticamente modificadas (GM). Plantas GM que expressam genes com atividade inseticida representam uma alternativa para o controle de insetos pragas mastigador, além de serem consistentes com a filosofia do manejo integrado de pragas (MIP) (Prokopy, 1994). As primeiras gerações de plantas GM resistentes a insetos mastigadores foram desenvolvidas com genes codificadores de proteínas inseticidas do entomopatógeno Bacillus thunringiensis Bt (Fischhoff et al.; 1987). A bactéria Bt é o organismo mais utilizado como fonte de genes para a transformação de plantas visando á resistência, principalmente, à lepidópteros e coleópteros (Perlak et al., 2001). Atualmente, culturas como soja, milho, algodão, batata e fumo, têm sido modificadas geneticamente, para expressar as proteínas derivadas da bactéria Bt, e são utilizadas em escala comercial em vários países, atingindo cerca de 102 milhões de hectares (James, 2012). 1 As Proteínas de Bt são expressas em altas doses nos tecidos verdes das plantas GM (Koziel et al., 1993). As proteínas ao serem expressas ficam expostas aos demais fitófagos não-alvos e aos seus inimigos naturais (Dutton et al, 2002). Embora Herrero et al., (2001), discutam que tais proteínas são altamente tóxicas e específicas, por isso inócuas para a maioria dos outros organismos, incluindo insetos benéficos, as plantas GM contendo gene bt interagem com os organismos não-alvo dos diferentes níveis troficos, pois as culturas abrigam não somente os insetos pragas, mas também outros artrópodes, os quais desempenham papel importante na regulação das populações de pragas (Schuler et al., 1999). A interação planta, fitófago e predadores é chamada de interação tritrófica, em que a planta representa o primeiro nível trófico, o fitófago ou inseto praga, o segundo nível e os inimigos naturais, o terceiro nível (Schuler et al., 1999). Algumas dúvidas em relação à transferência da proteína têm despertado o interesse dos pesquisadores entre elas estão: há possibilidade das plantas GM afetarem os organismos não-alvo de diferentes níveis tróficos (e.g. fitófagos e predadores) e há evolução da resistência de pragas às proteínas de B. thuringiensis (Obrist et al., 2006a). As plantas GM, como o milho (Zea mays L) que expressam a Proteína Bt, podendo ser considerada como uma tática adicional para o controle de insetos pragas com eficácia semelhante aos inseticidas convencionais, além de serem compatíveis com os princípios do Manejo Integrado de Pragas (MIP) (Paoletti & Pimentel, 2000). As principais vantagens do uso do milho GM são: redução de aplicação de inseticidas e aumento na produção (Huang et al., 2002). A produtividade das lavouras do milho é afetada pela ação de pragas. A lagarta-docartucho, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), é praga primária da cultura do milho no Brasil causando sérios prejuízos à produção (Cruz, 1995). A cultura do Milho ocupa a maior extensão entre todas as lavouras no Brasil, com área de plantio em torno de 15 milhões de hectares e produção estimada em 71,1 milhões de toneladas (CONAB, 2012). Fitófago considerado não alvo da Proteína do milho Bt, como o ácaro-rajado Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) uma das mais importantes pragas polífagos de hortaliças e outras culturas (Capinera, 2001; Opit et al., 2004; Liburd et al., 2007). O ácaro-rajado Tetranychus urticae é conhecido como uma das maiores pragas em muitas culturas, ele pode ser encontrado em plantas de numerosas espécies (Bolland et al., 1998). Infestações causadas por T. urticae podem resultar em queda das folhas, diminuição do vigor e morte da planta (Kranz et al., 1977). T. urticae é uma praga comum de maçãs, cerejas e 2 frutas podem infestar folhas e sugar fluidos a partir das células e podem desfolhar árvores (Beers et al., 1993). O ácaro-rajado pode causar infestações nas folhas de plantas GM e convencionais, mas o T. urticae não é alvo de plantas modificadas com a Proteína Bt, o que pode acarretar modificações adaptativas nos ácaros e em seus inimigos naturais ao longo das gerações. Li & Romeis (2010) avaliaram o possível efeito da Proteína Bt ao longo da cadeia alimentar de T. urticae e seu inimigo natural o besouro predador Stethorus punctillum Weize (Coleoptera: Coccinellidae), onde nenhum efeito adverso da Proteína Bt expressada em milho sobre T. urticae e seu predador S. punctillum foi detectado. As proteínas presentes em plantas GM podem ser adquiridas e concentradas pelos ácaros fitófagos. (Dutton et al., 2002) verificou que, comparando a outros herbívoros mastigadores e sugadores alimentados com milho Bt, T. urticae apresentou a maior quantidade da toxina. A proteína permanece biologicamente ativa nos ácaros de acordo com Obrist et al., (2006). Dutton et al., (2002) verificou que ocorreu decrescimo na taxa de crescimento da população de T. urticae criada em milho Bt, comparada com a população mantida na variedade de milho não Bt. As plantas transgênicas podem afetar o comportamento dos ácaros fitófagos, quando submentidos a estudos de preferência. Fêmeas adultas de T.urticae preferiram a variedade de berinjela (Solanum melongena) que expressam a Proteína Cry3Bb que a convencional. Além disso, T.urticae também apresentou maior taxa de oviposição nesta variedade transgênica (Rovenská et al., 2005). Vários trabalhos têm estudado insetos, entretanto um número reduzido foi realizado sobre os efeitos de plantas Bt sobre ácaros fitófagos (Dutton et al., 2002; Lozzia, 1999; Lozzia et al., 1998; Pilcher et. al., 1997). O ácaro-rajado apresenta susceptibilidade a formulações comerciais de Bt e capacidade em adquirir e manter Proteínas Bt da planta hospedeira no seu corpo (Dutton et al, 2002). Tem-se questionado sobre o possível efeito dessa proteína sobre seus predadores (Torres & Ruberson, 2008). É provável que a proteína possa ser transferida dos ácaros para o terceiro nível trófico, ou seja, os predadores. Os principais questionamentos estão há possibilidade das plantas GM afetarem os organismos não-alvo de diferentes níves tróficos e há possibilidade de evolução de resistência de pragas à Proteína de Bt, pois as plantas irão expressar a Proteína de Bt durante o ciclo da cultura (Tabashnik,1994). O milho Bt, expressa Proteínas Cry1F e Cry1Ab, onde confere resistência ao ataque de vários de lepidópteros (Peixoto, 1999), o que reduz significativamente os danos causados por 3 essas espécies em lavouras (Chilcutt et al., 2007). Além das proteínas inseticidas expressas por genes cry, existem as Proteínas Vip3a (Proteínas Inseticidas Vegetativas) (Impacto Viptera), onde conferem resistência ao ataque de lepidópteros, que também são produzidas através de cepas de Bt em sua fase vegetativa (Bernardi et al., 2012). Estas proteínas atuam de modo semelhante àquele utilizado pelas Proteínas Cry, porém suas propriedades de ligação aos sítios no intestino médio dos insetos são diferentes, o que reduz as possibilidades de resistência cruzada entre Proteínas Cry e VIP (Hardke et al., 2011). Esta dissertação tem como objetivo avaliar, no capítulo I a abundância e riqueza de espécies de ácaros fitógagos em lavouras de milho GM contendo o gene bt, expressando as Proteínas Cry1Ab (30F35 Yg) e Cry1F (30F35 Hx) Vip3a (Impacto Viptera). Para tanto, serão realizados levantamento da riqueza e abundância espécies de ácaros em plantios de milho no campo. No capítulo II avaliar-se-á a preferência alimentar e a taxa instantânea de crescimento de Tetranychus urticae entre plantas de milho Bt, expressando as Proteínas Cry1Ab, Cry1F e Vip3a e isogênico não Bt. Para tanto serão relizados testes em laboratório. Este é o primeiro estudo a ser realizado com ácaros em milho no Brasil. 4 2. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA AMENT, K.; KANT, M.R.; SABELIS, M.W.; HARING, M.A.; SCHUURINK, R.C. Jasmonic acid is a key regulator of spider mite-induced volatile terpenoid and methyl salicylate emission in tomato. Plant Physiology, Rockville, v.135, p , BECERRA, J.X. Squirt-gun defense in Bursera and the chrysomelid counterploy. Ecology. v.75, p , BERNARDI, O.; MALVESTITI, G.S.; DOURADO, P.M.; OLIVEIRA, W.S.; MARTINELLI, S.; BERGER, G.U; HEAD, G.P.; OMOTO, C. Assessment of the high dose concept and level of control provided by MON x MON soybean against Anticarsia gemmatalis and Pseudoplusia includens (Lepidoptera: Noctuidae) in Brazil. Pest. Manag. Sci. v.68, p , BEERS, E.H.; BRUNNER, J.F.; WILLETT, M.J.; WARN
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