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TESE DOUTORADO - Nelson A M Lemos

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1. Universidade Federal do Rio Grande do Norte NELSON A. M. LEMOS TAXA DE DISPAROTAXA DE DISPAROTAXA DE DISPAROTAXA DE DISPARO EEEE…
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  • 1. Universidade Federal do Rio Grande do Norte NELSON A. M. LEMOS TAXA DE DISPAROTAXA DE DISPAROTAXA DE DISPAROTAXA DE DISPARO EEEE ATIVAÇÃOATIVAÇÃOATIVAÇÃOATIVAÇÃO DE ASSEMBLÉIASDE ASSEMBLÉIASDE ASSEMBLÉIASDE ASSEMBLÉIAS NO HIPOCAMPO DENO HIPOCAMPO DENO HIPOCAMPO DENO HIPOCAMPO DE RATOSRATOSRATOSRATOS DURANTE O PROCESSAMENTO DE UMADURANTE O PROCESSAMENTO DE UMADURANTE O PROCESSAMENTO DE UMADURANTE O PROCESSAMENTO DE UMA MEMÓRIA AVERSIVAMEMÓRIA AVERSIVAMEMÓRIA AVERSIVAMEMÓRIA AVERSIVA NATAL – RN 2012
  • 2. NELSON A. M. LEMOS TAXA DE DISPARO E ATIVAÇÃO DE ASSEMBLÉIAS NO HIPOCAMPO DE RATOS DURANTE O PROCESSAMENTO DE UMA MEMÓRIA AVERSIVA NATAL – RN 2012 Trabalho de defesa de doutorado em Psicobiologia apresentado à U- niversidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientador: Dr. Sidarta Tollendal Gomes Ribeiro Co-orientadora: Dra. Regina Helena Silva
  • 3. II Dedicado à amizade, sem a qual tudo se torna insuportável e, muitas vezes, intransponível. A força nasce no profundo silêncio dos corações bastante sofridos; não em meio à alegria. ARTHUR HELPS
  • 4. III AGRADECIMENTOS Foi uma longa jornada. Em verdade, mais longa do que eu gostaria e bastante ardilosa. Porém, tive a sorte de encontrar algumas pessoas que aliviaram as dores ao percorrer esse vale sombrio. Mamãe, como sempre, pela dedicação, amor e paciência para com esse vosso filho, tem meu amor e minha gratidão. Aos amigos: Tárik, pela amizade longa que a distancia não separa e pela fé de que eu poderia terminar isso, quando nem mesmo eu mais acreditava. André, o que dizer? Acho que aqui cabe bem citar o credo de Quirion: “Lute com um amigo em suas costas, aço em suas mãos e ma- gia em suas veias”. Obrigado por ser esse amigo. Daniel, que surpresa agradável conhecê-lo nessa reta final. Não apenas deu uma ajuda de peso com as análises e discussões, mas acre- dito que fiz amizade com uma pessoa extraordinária. Obrigado por tudo. Ernesto, precisei importar ajuda do outro lado do Atlântico. O- brigado irmão pelas nerdices e pelas horas a fio escrevendo código. Luane, querida amiga. Foi um privilégio ter participado de sua formação. Espero ter contribuído positivamente. Pode contar comigo sempre que precisar. Muito obrigado por sua ajuda durante meu douto- rado, saiba que ela foi essencial. Marcão, você é o cara! No princípio, éramos nós. Valeu pela ami- zade, pelo trabalho insano e pela força. “The show must go on!” Ronaldo, obrigado pelo apoio e pela amizade esses anos todos. Vitor, mandou bem nos comentários e nas discussões. Valeu pe- la ajuda, foi de suma importância, pode ter certeza. Pra não mencionar a ferramenta das assembleias...
  • 5. IV Aos mestres: Adriano, você abriu as portas do Matlab. Agora dominarei o mundo. Alessandra, aprendi muito com suas críticas e comentários. O- brigado pela sua confiança. John, você foi como um pai aqui em Natal. Obrigado pelos ensi- namentos e pelas cervejas, não necessariamente nessa ordem. Aos orientadores: Obrigado. Muito obrigado. Aprendi muito durante essa cami- nhada com vocês. Talvez eu tenha demorado muito tempo para assimi- lar lições que estavam bem a minha frente, mas em retrospecto, posso afirmar hoje que finalmente eu as aprendi. Vocês me proporcionaram a condição para descobrir e conquistar minha própria força. Logicamente, muito mais pessoas passaram por minha vida que aqui eu não estou explicitamente mencionando. Todos contribuíram, senão em meu trabalho, na formação de meu caráter. Obrigado a todos, sejam pelas alegrias ou pelas tristezas compartilha- das e proporcionadas. Ambas foram muito importantes. The way out is forward. Onward to battle!
  • 6. V A coleta de dados experimentais da presente tese foi desenvolvida no Laboratório de Neurobiologia Celular do Instituto Internacional de Neu- rociências de Natal Edmond e Lily Safra (IINN-ELS). A análise de dados e a preparação do texto ocorreram no Instituto do Cérebro da Universi- dade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O trabalho utilizou recursos financiados pelo Conselho Nacional de De- senvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação (MCTI), da Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), do Programa Pew Latin American Fellowship in the Biomedical Sciences e da Associação Alberto Santos Dumont para Apoio à Pesquisa (AASDAP).
  • 7. VI SUMÁRIO LISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURASLISTA DE FIGURAS VIIIVIIIVIIIVIII LISTA DE TABELASLISTA DE TABELASLISTA DE TABELASLISTA DE TABELAS IIIIIXIXIXIX LISTA DE ABREVIALISTA DE ABREVIALISTA DE ABREVIALISTA DE ABREVIAÇÕESÇÕESÇÕESÇÕES XXXX RESUMORESUMORESUMORESUMO XIXIXIXI ABSTRACTABSTRACTABSTRACTABSTRACT XIIXIIXIIXII 1111 –––– INTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃOINTRODUÇÃO 1111 1.1 – MEMÓRIA E APRENDIZAGEM 3 1.1.1 – MEMÓRIA E SEUS MECANISMOS 7 1.2 – HIPOCAMPO 11 1.2.1 – ESTRUTURA ANATÔMICA 12 1.2.2 – O HIPOCAMPO E A MEMÓRIA 15 1.3 – ASSEMBLÉIAS NEURONAIS 17 1.4 – O SONO 20 1.4.1 – SONO E MEMÓRIA 24 1.5 – ESQUIVA DISCRIMINATIVA 27 1.6 – REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO 29 2222 –––– OBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOSOBJETIVOS 31313131 2.1 – OBJETIVOS GERAIS 31 2.2 – OBJETIVOS ESPECÍFICOS 31
  • 8. VII 3333 –––– MATERIAIS E MÉTODOSMATERIAIS E MÉTODOSMATERIAIS E MÉTODOSMATERIAIS E MÉTODOS 32323232 3.1 – ANIMAIS 32 3.2 – ESQUIVA DISCRIMINATIVA 33 3.3 – REGISTRO DA ATIVIDADE NEURAL HIPOCAMPAL 34 3.3.1 – IMPLANTE DE MULTI-ELETRODOS E REGISTRO ELETROFISIOLÓGICO 34 3.3.2 – MATRIZES DE ELETRODOS 36 3.3.3 – IMPLANTE CIRÚRGICO DAS MATRIZES DE ELETRODO NO HIPOCAMPO 38 3.3.4 – AQUISIÇÃO COMPUTADORIZADA DE DADOS NEURAIS 40 3.3.5 – DISCRIMINAÇÃO DE UNIDADES NEURAIS EM TEMPO REAL 41 3.3.6 – PROTOCOLO EXPERIMENTAL 44 3.3.7 PERFUSÃO E PREPARAÇÃO DO TECIDO 46 3.4 – ANÁLISE DOS DADOS COMPORTAMENTAIS 47 3.5 – ANÁLISE DOS DADOS ELETROFISIOLÓGICOS 48 3.5.1 – DETECÇÃO DO ESTADO COMPORTAMENTAL. 48 3.5.2 – TAXAS DE DISPARO NEURAL 50 3.5.3 – DETECÇÃO E ATIVIDADE DE ASSEMBLEIAS NEURONAIS 51 4444 –––– RESULTADOSRESULTADOSRESULTADOSRESULTADOS 53535353 4.1 – RESULTADOS COMPORTAMENTAIS 53 4.2 – IMPLANTE DE ELETRODOS 56 4.3 – TAXAS DE DISPARO NEURONAL 57 4.4 – ANÁLISE DAS ASSEMBLEIAS NEURONAIS 61 5555 –––– DISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃODISCUSSÃO 67676767 6666 –––– REFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIASREFERÊNCIAS 78787878 ANEXO I: PROTOCOLO PANEXO I: PROTOCOLO PANEXO I: PROTOCOLO PANEXO I: PROTOCOLO PARA IMPLANTE DE MATRARA IMPLANTE DE MATRARA IMPLANTE DE MATRARA IMPLANTE DE MATRIZ DE ELETRODOSIZ DE ELETRODOSIZ DE ELETRODOSIZ DE ELETRODOS 86868686
  • 9. VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1.1 – Esquema da formação hipocampal. ___________________________________ 13 Figura 1.2 – Morfologia Hipocampal. _____________________________________________ 14 Figura 1.3 – Efeitos do hipocampo sobre a memória aversiva._________________________ 16 Figura 1.4 – Reativação de assembleias neuronais durante o sono. ____________________ 19 Figura 1.5 – Características dos estados comportamentais de vigília, não-REM e REM. ____ 21 Figura 1.6 – Principais Oscilações Hipocampais. ___________________________________ 22 Figura 1.7 – Efeito da privação de sono sobre a memória. ____________________________ 24 Figura 3.1 – Matriz de múltiplos eletrodos. ________________________________________ 37 Figura 3.2 – Implante cirúrgico de uma matriz de eletrodos.___________________________ 39 Figura 3.3 – Seleção de multi-unidades neurais.____________________________________ 43 Figura 3.4 – Desenho do experimento. ___________________________________________ 45 Figura 3.5 – Classificação de estado comportamental. _______________________________ 49 Figura 4.1– Tempo de exploração dos braços abertos e do braço aversivo_______________ 54 Figura 4.2 – Tempo de permanência total no braço aversivo.__________________________ 54 Figura 4.3 – Histologia de Nissl para confirmar a posição dos eletrodos._________________ 56 Figura 4.4 – Contagem de disparos neuronais antes e depois da exposição ao labirinto. ____ 57 Figura 4.5 – Alteração percentual da taxa média de disparo durante o SOL antes e depois da exposição ao labirinto. ________________________________________________________ 58 Figura 4.6 – Comparação entre animais da diferença de taxa de disparo durante o SOL antes e depois da exposição ao labirinto.________________________________________________ 60 Figura 4.7 – Quantidade de assembleias neuronais ativadas. _________________________ 62 Figura 4.8 – Picos de forte atividade das assembleias neuronais. ______________________ 63 Figura 4.9 – Atividade total das assembléias neuronais.______________________________ 65 Figura 4.10 – Atividade neuronal e comportamento. _________________________________ 66
  • 10. IX LISTA DE TABELAS Tabela 4.1 – Duração dos episódios de SOL por animal (min). ________________________ 55 Tabela 4.2 – Número de assembleias detectadas por sessão experimental. ______________ 61 Tabela 4.3 – Número de neurônios registrados por sessão experimental. ________________ 61
  • 11. X LISTA DE ABREVIAÇÕES ACP – Análise de componentes principais; AMPA – ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiônico CT – Controle, grupo; DAPI – Dihidrocloreto de 4',6-diamidino-2-fenilindole DLD – Depressão de longa duração; NMDA – N-metil-D-aspartato PB – Phosphate buffer, tampão fosfato; PLD – Potenciação de longa duração; POS – Pós-exposição ao labirinto, grupo; PRE – Pré-exposição ao labirinto, grupo; REM – Rapid eyes movement, movimento rápido dos olhos; RNA – Ribonucleic Acid, ácido ribonucleico; SOL – Sono de ondas lentas; SP – Sono paradoxal; TE – Teste, grupo; TR –Treino, grupo;
  • 12. XI RESUMO Hebb postulou que a memória poderia ser armazenada graças a atividade síncrona de vários neurônios, formando um assembleia neu- ral. Sabendo da importância da estrutura hipocampal para a formação de novas memórias explícitas, utilizamos o registro eletrofisiológico de múltiplos neurônios para investigar a relevância da codificação de taxa (rate coding) dos disparos neurais, comparada com a codificação tempo- ral (temporal coding) da atividade de assembleias, na consolidação de uma memória aversiva de ratos. Os animais foram treinados na esquiva discriminativa usando um labirinto em cruz elevado modificado. Duran- te as sessões experimentais foram registrados períodos de sono de on- das lentas (SOL). Nossos resultados indicam um aumento da atividade das assembleias neuronais identificadas durante o SOL após o treino na tarefa, sendo que o mesmo não acontece com a taxa de disparo. Em re- sumo, demonstramos que para essa tarefa em particular, a informação relevante à consolidação adequada da memória está codificada nos pa- drões temporais de sincronização da atividade neural e não em sua taxa de disparo.
  • 13. XII ABSTRACT Hebb postulated that memory could be stored thanks to the syn- chronous activity of many neurons, building a neural assembly. Know- ing of the importance of the hippocampal structure to the formation of new explicit memories, we used electrophysiological recording of multi- ple neurons to access the relevance of rate coding from neural firing rates in comparison to the temporal coding of neural assemblies activity in the consolidation of an aversive memory in rats. Animals were trained at the discriminative avoidance task using a modified elevated plus-maze. During experimental sessions, slow wave sleep periods (SWS) were recorded. Our results show an increase in the identified neural assemblies’ activity during post-training SWS, but not for the neural firing rate. In summary, we demonstrate that for this particular task, the relevant information needed for a proper memory consolida- tion lies within the temporal patters of synchronized neural activity, not in its firing rate.
  • 14. 1 1 – INTRODUÇÃO Se eu vi mais longe, foi por estar de pé sobre o ombro de gigantes. SIR ISAAC NEWTON As memórias nos outorgam nossa identidade e individualidade. Muito do que somos é reflexo do acúmulo de experiências pessoais pas- sadas e a forma como lidamos com elas. Para o célebre escritor e dra- maturgo irlandês Oscar Wilde, “memória é o diário que todos nós carre- gamos conosco” (do original “memory is the diary that we all carry about with us”). Embora o conceito científico de memória não difira muito do senso comum – todos tem uma ideia geral sobre do que consiste e para que serve uma memória – uma definição mais formal cabe bem ao pro- pósito da tese. O termo memória pode se referir a coisas relacionadas, mas no entanto, diferentes. Podemos nos referir a um evento passado específico (uma lembrança) ou então à capacidade de armazenar e recordar infor- mações. Uma definição do termo não é algo tão simples uma vez que, como veremos, a memória não é um “bloco” único, mas sim diversos sistemas agrupados sob um mesmo nome. Assim, memória é tanto uma representação interna de experiências passadas que persiste com o tempo como também um processo, a capacidade de codificar, armaze- nar, consolidar e resgatar informações (Roediger et al. 2007). Ao longo
  • 15. 2 desse texto, estaremos utilizando principalmente a segunda definição do termo. Esse assunto nos permite fazer várias perguntas, todas muito simples: “Como nos lembramos? O que faz com que possamos adquirir uma determinada informação e, posteriormente, lembrarmo-nos dela a qualquer momento? Quais são as estruturas neurais envolvidas nesses processos?” As respostas, entretanto, são bastante complexas e longe de estarem completas. Ao passo em que o comportamento animal ainda é, em muitos aspectos, indispensável para se estudar o complexo fenômeno – dado que não podemos indagar diretamente um rato – ferramentas modernas como a eletrofisiologia de múltiplos neurônios agregam valor aos expe- rimentos e permitem explorá-lo de maneira invasiva. Considerando o registro da atividade neuronal em particular, uma questão importante é a de como interpretar o sinal gerado por es- sas células excitáveis. Eric Kandel, laureado com um prêmio Nobel em Medicina e Fisi- ologia, afirma que o século XXI, apenas em seu início, será o século da neurociência, como o século passado foi da biologia molecular – ou seja, ainda há muito para descobrirmos (Kandel 2007). O presente trabalho espera contribuir de alguma forma com o grande quebra-cabeça que é o estudo da memória, adicionando mais uma pequena peça ao quadro.
  • 16. 3 1111....1111 –––– Memória e ApMemória e ApMemória e ApMemória e Aprrrrendizagemendizagemendizagemendizagem O pioneiro no estudo da memória como assunto científico foi Hermann Ebbinghaus, no final do século XIX. Ele elaborou uma lista de sílabas a ser decorada e que, depois de algum tempo, deveria ser recita- da. Assim, a quantidade de sílabas lembradas se torna uma medida di- reta da memória do sujeito, o que permitiu traçar uma curva de esque- cimento, mostrando como varia a quantidade de palavras lembradas ao longo do tempo e o efeito de um maior treinamento sobre a retenção das mesmas (Ebbinghaus 2010). A partir desse conceito, podemos fazer o raciocínio inverso para obter uma curva de aprendizado. Apesar desse trabalho ter contribuído enormemente fundando termos e criando essas duas importantes medidas usadas até hoje (curvas de aprendizado e esquecimento), seu grande mérito foi o de colocar a memória definitiva- mente no campo científico, como um fenômeno observável e mensurá- vel, desmistificando sua subjetividade através de um experimento com- portamental elegante e extremamente simples. Uma vez demonstrado que o tema memória poderia ser investi- gado com o rigor científico, vários cientistas foram em busca de respos- tas acerca do fenômeno. Uma pergunta fundamental sobre o tema memória diz respeito à localização da mesma no encéfalo. Karl Lashley perseguiu esse tema realizando um experimento em animais bastante simples. Em sua bus- ca pelo engrama – o traço da memória – treinou ratos para percorrer um labirinto em zigue-zague com recompensa alimentar no final do trajeto.
  • 17. 4 À medida que os animais aprendiam o caminho, o tempo para saírem do labirinto era cada vez menor. Uma vez bem treinados na tarefa, Las- hley realizou cirurgias nesses animais para lesionar diferentes áreas corticais com variados graus de extensão. A ideia seria tentar lesar um local onde a memória relativa ao evento codificado residiria após percor- rer um caminho neural específico. Entretanto, concluiu que, indepen- dente da região lesionada, sempre havia prejuízo no desempenho da ta- refa, sendo o mesmo proporcional apenas à quantidade de tecido remo- vido. Lashley então postulou que a memória estaria igualmente distri- buída pelo cérebro, o chamado princípio da igualdade de massas (Las- hley 1950). O erro de Lashley foi não considerar que as regiões corticais lesionadas poderiam não ter uma relação direta com o processo mne- mônico mas simplesmente reger atividades sensório-motoras que, se prejudicadas, afetariam tanto a capacidade do animal locomover-se no labirinto como a de obter informações sensoriais sobre o mesmo. Na é- poca, entretanto, o conceito foi aceito pela comunidade e alguns anos passaram até que esse princípio fosse desafiado. Em 1957, Scoville e Milner publicaram um artigo que seria um marco na história da neurociência. Nele, os autores descrevem vários casos de perda de memória recente, dentre os quais um em particular: o caso do paciente H.M. Henry Molaison sofria de epilepsia resistente ao tratamento por drogas e foi submetido a uma cirurgia de ablação bilate- ral do foco epiléptico – no caso, o tecido correspondente ao lobo tempo- ral medial. Apesar de bem sucedida – a epilepsia foi completamente cu- rada – a cirurgia provocou um efeito colateral não previsto: além de
  • 18. 5 uma perda de memória retrógrada relativamente recente (de alguns a- nos antes da cirurgia), H.M. era agora incapaz de reter novas memórias (Scoville and Milner 1957). Assim, finalmente uma região cerebral en- volvida com o processo de formação de novas memórias havia sido loca- lizada no lobo temporal medial, circunscrita em uma estrutura particu- lar chamada hipocampo. Investigações posteriores revelaram que H.M. era capaz de a- prender tarefas motoras, como desenhar com o auxílio de um espelho; no entanto, embora apresentasse melhoras progressivas no traçado, não sabia de forma consciente que possuía tal habilidade (Milner 1962). Essas duas informações levaram a conclusões fundamentais sobre a memória: (1) a memória pode ser classificada temporalmente, desde mais recentes até mais remotas e (2) existem tipos de memória qualita- tivamente distintos, sejam para informações conscientes ou motoras (Squire 2004). Atualmente, nos referimos a memórias de curta ou de longa du- ração (dependendo do tempo em que elas permaneceram no sistema e dos processos bioquímicos pelos quais passaram) e também a tipos qualitativamente distintos, como as memórias explícitas (fatos, lugares, pessoas) e implícitas (hábitos e procedimentos motores), processos os quais dependem de estruturas encefálicas diferentes (Izquierdo and Me- dina 1995; Squire 2004; McGaugh 2000). Apesar de existir uma propos- ta de reclassificação dos tipos de memória, de modo a enquadrá-los ba- seado em sua função e estrutura, as nomenclaturas clássicas ainda predominam (Henke 2010).
  • 19. 6 Nesse trabalho vamos nos deter a memórias explicitas (hipo- campais) de longa duração.
  • 20. 7 1.1.1 – Memória e seus Mecanismos Hebb postulou em 1949 que para que ocorra a formação de uma memória, é necessário que ocorra: (1) uma reverberação da informação no sistema seguido de (2) uma modificação estrutural (morfológica) dos sistemas envolvidos (Hebb 1949). Essa teoria do traço dual da memória foi corroborada ao longo dos anos que se seguiram, ganhando evidência e força. Sabemos hoje, por exemplo, que a atividade neuronal sustenta- da e o aumento da arborização dendrítica, bem como a inserção de mais receptores pós-sinápticos atuam no se
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