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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Idetificação de polimorfismos o gee do IGF-I em bovios (Bos taurus) da
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS CURSO DE GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO Idetificação de polimorfismos o gee do IGF-I em bovios (Bos taurus) da raça Crioula Lageaa. Vaessa Laus da Rosa Trabalho de Coclusão de Curso apresetado ao curso de Agroomia, o Cetro de Ciêcias Agrárias, da Uiversidade Federal de Sata Cataria, como requisito para obteção do título de Egeheira Agrôoma. Orietador: Prof. Dr. Adré Ferreira Lima Floriaópolis - SC Novembro/2016 Vaessa Laus da Rosa Idetificação de polimorfismos o gee do IGF-I em bovios (Bos taurus) da raça Crioula Lageaa. Trabalho de Coclusão de Curso apresetado ao curso de Agroomia, o Cetro de Ciêcias Agrárias, da Uiversidade Federal de Sata Cataria, como requisito para obteção do título de Egeheira Agrôoma. Orietador: Prof. Dr. Adré Ferreira Lima Floriaópolis - SC Novembro/2016 Idetificação de polimorfismos o gee do IGF-I em bovios (Bos taurus) da raça Crioula Lageaa Vaessa Laus da Rosa (1) * (demais autores a serem icluídos futuramete para evio do mauscrito) (1) Acadêmica do curso de Agroomia do Cetro de Ciêcias Agrárias da Uiversidade Federal de Sata Cataria, Floriaópolis, SC, Brasil.* Autor correspodete - Resumo: O gee do IGF-I (Fator I de Crescimeto Semelhate à Isulia) é um bom cadidato a marcador molecular de bovios devido a sua relação com características de iteresse ecoômico como fuções de crescimeto e precocidade sexual, podedo assim ser usado como ferrameta a seleção assistida em programas de melhorameto geético para a espécie. O objetivo desse trabalho foi idetificar a possível existêcia de polimorfismos o gee do IGF-I em bovios da Raça Crioula Lageaa através da técica PCR-RFLP com a ezima de restrição Hif-I (Ivitroge). Foi realizada a extração do DNA de amostras de pelos da vassoura da cauda de 66 aimais da raça Crioula Lageaa de fazedas de criação localizadas a região do muicípio de Lages em Sata Cataria. As aálises foram coduzidas o Laboratório de Esio e Pesquisa em Geética Aimal (LEPGA), o Cetro de Ciêcias Agrárias da Uiversidade Federal de Sata Cataria, em Floriaópolis/SC. A extração de DNA foi realizada com uma adaptação da metodologia de PCI (feol-clorofórmio-álcool isoamílico). A efetividade do procedimeto foi verificada por meio de eletroforese em gel de agarose e as amostras cosideradas satisfatórias foram amplificadas por meio de PCR, posteriormete os fragmetos obtidos foram submetidos à técica de PCR-RFLP utilizado a ezima ateriormete mecioada. Foram observados polimorfismos geéticos que origiaram três padrões distitos de migração: VV, VS e SS, com frequêcias observadas iguais a 0,238, 0,587 e 0,175, respectivamete. Testes de aderêcia idicaram que as frequêcias para o alelo estudado ão estão em equilíbrio de Hardy-Weiberg. Os resultados obtidos este trabalho permitem iferir que foi possível idetificar polimorfismos para a região estudada do gee do IGF-I em aimais da raça Crioula Lageaa. Palavras-chave: Precocidade, Seleção Assistida, PCR-RFLP, Marcadores Moleculares Abstract The IGF-I gee (Isuli-like Growth Factor I) is a good cadidate for bovie molecular marker due to its relatio with characteristics of ecoomic iterest such as growth ad sexual precocity fuctios, ad ca therefore be used as a tool i assisted selectio I breedig programs for species. The aim of this work was to idetify the possible existece of polymorphisms i the IGF-I gee i Crioula Lageaa breed cattle usig the PCR-RFLP techique with the restrictio ezyme Hif-I (Ivitroge). The DNA extractio of samples of broom hairs from the tail of 66 Crioula Lageaa aimals from farms located i the regio of Lages city i Sata Cataria was performed. The aalyzes were coducted at the Aimal Geetics Teachig ad Research Laboratory (LEPGA), at the Agricultural Scieces Ceter of the Federal Uiversity of Sata Cataria, Floriaópolis / SC. DNA extractio was performed with a adaptatio of the PCI (pheol-chloroformisoamyl alcohol) methodology. The effectiveess of the procedure was verified by agarose gel electrophoresis ad the samples cosidered satisfactory were amplified by PCR techique, later the obtaied fragmets were submitted to PCR-RFLP techique usig the aforemetioed ezyme. Geetic polymorphisms were observed by three differet migratio patters of DNA fragmets after digestio: VV, VS ad SS with observed frequecies equal to 0.238, ad 0.175, respectively. Chi square tests were performed idicatig that the allelic frequecies are ot uder Hardy-Weiberg s equilibrium. The results obtaied allows to coclude that was possible to idetify geetic polymorphisms for the studied regio o IGF-I hormoe gee o aimals from Crioulo Lageao breed. Keywords: precocity, assisted selectio PCR-RFLP, Molecular markers 1 1. Itrodução O rebaho bovio o Brasil cota com aproximadamete 215 milhões de cabeças, deste total, a boviocultura de corte represeta uma grade parcela de ídices favoráveis a produção, cosumo itero e volume exportado de care (IBGE, 2016; ABIEC, 2016a). Segudo o Miistério da Agricultura (2016b), a expectativa é que até 2020 a produção brasileira de care bovia supra até 44,5% do mercado mudial. Os segmetos da boviocultura de corte e de leite estão presetes em todos os estados brasileiros evideciado tato a importâcia ecoômica quato a importâcia social da atividade para o país (MAPA, 2016a). Para que o país mateha-se em destaque o mercado mudial a boviocultura precisa estar em costate evolução, melhorado cotiuamete seus ídices zootécicos. Dia-a-dia ferrametas são criadas e aperfeiçoadas buscado aumetar a produção e eficiêcia da atividade, etre elas o desevolvimeto tecológico as áreas de geética, reprodução, saúde, utrição e maejo aimal (INDEPENDÊNCIA, 2010). No Brasil já foram itroduzidas e experimetadas diversas raças bovias desde a época do descobrimeto, raças trazidas pelos descobridores e raças importadas, iicialmete as taurias (Bos taurus) e posteriormete as zebuías idiaas (Bos idicus) (PEIXOTO, 2010). O rebaho brasileiro atualmete é formado 80% por raças zebuías, devido pricipalmete à rusticidade e adaptação da espécie ao ambiete de clima tropical predomiate o país. Na região sul do Brasil as características edafoclimáticas caracterizadas por temperaturas mais baixas e pastages de mais alto valor utricioal permitem a adaptação de raças taurias (Bos taurus) como as cotietais, que possuem grade potecial de gaho de peso, alto redimeto de carcaça e são produtoras de cares mais obres que as zebuías (ABIEC, 2016b, EUCLIDES FILHO e EUCLIDES, 2010). O Crioulo Lageao é uma raça de Bos taurus aturalizada o plaalto Sulbrasileiro, especificamete a região do muicípio de Lages, o estado de Sata Cataria. Essa raça se desevolveu e foi aturalmete selecioada durate 300 aos sob codições adversas de clima e pastagem, torado-se pleamete adaptada ás codições ecológicas da região defiidas por iveros rigorosos com icidêcia de geadas e pastages proveietes de solos ácidos e pedregosos. (RANGEL et al., 2004; MARIANTE, 1993). Os aimais da raça Crioula Lageaa são caracterizados por seus logos chifres (existido também a variedade mocha), porte avatajado e alta prolificidade. Nas 2 codições do plaalto catariese apresetam excelete produção leiteira, forte aptidão matera, facilidade o parto, resistêcia a determiadas efermidades e a edo e ectoparasitas, adaptação às codições desfavoráveis de pastagem as épocas críticas do ao além de grade logevidade. Mesmo sem ter sofrido logos períodos de seleção artificial a velocidade de crescimeto do Crioulo Lageao se compara a da raça Charolês e é superior a do Nelore em codições de pastagem do Plaalto Serrao Catariese (PAYNE, 1970; RIBEIRO, 1993). Além disso, Veiga (2011) costatou que a raça Crioula Lageaa possui características qualitativas de care superiores as da raça Nelore, apresetado área de olho de lombo, escore de marmoreio e espessura de gordura subcutâea superiores. O melhorameto aimal é uma ciêcia e uma tecologia de grade importâcia para aumetar a produtividade e eficiêcia das atividades pecuárias. Nas últimas décadas essa ferrameta tem sido favorecida pelo aprimorameto de tecologias como o uso de marcadores moleculares que cosistem em alterações a sequêcia de ucleotídeos do DNA etre idivíduos da mesma população, deomiadas de polimorfismos (SALMAN et al. 2009). Esses polimorfismos podem estar associados a características de iteresse e seu uso permite idetificar o potecial geético de um aimal ates da expressão de seu feótipo (REGITANO E COUTINHO, 2001). A seleção assistida por marcadores traz grades expectativas ao melhorameto aimal uma vez que aumeta a precisão de predição dos métodos de seleção tradicioais reduzido o itervalo etre gerações e cosequetemete aumetado o gaho geético, permitido a obteção de resultados preferíveis, com melhor qualidade e meor variação dos produtos produzidos (GIL, 2012). Etre os marcadores de DNA, os chamados gees cadidatos têm sido utilizados com este propósito, em fução da sua ligação a compostos como hormôios de cohecida fução fisiológica. O IGF-I (Fator I de Crescimeto Semelhate à Isulia) também cohecido como somatomedia C é um forte cadidato a marcador molecular devido a sua relação com fuções de crescimeto e precocidade sexual. Esse gee, localizado o cromossomo 5 bovio é resposável pela sítese de um peptídeo composto por 70 amioácidos pertecete à superfamília da isulia, que possui relação estrutural com a pró-isulia e têm atividade sobre o metabolismo itermediário, a proliferação, o crescimeto e a difereciação celular (JONES e CLEMMONS, 1995; BISHOP et al., 1994; ANDOH, 2005). O IGF-I também age como mediador metabólico relacioado com o iício da puberdade em ovilhas (RADCLIFF et al., 2004; BELTRAN, 2007). 3 A importação de raças exóticas e o cruzameto idiscrimiado das mesmas acarretaram a redução do platel de muitas raças crioulas como a Crioula Lageaa que atualmete possui cerca de 3000 aimais cotra mais de que já existiram a coquista do Plaalto Serrao pelos badeirates o século XVIII e que perduraram até os primeiros aos do século XX (MARTINS, et al., 2009). As características próprias dos produtos do Crioulo Lageao os toram fortes cadidatos a coseguir a certificação de origem valorizado aida mais os produtos regioais. Projetos que caracterizem e melhorem a raça são importates ão só para coservação da mesma, mas também da atureza e da cultura de toda região ode ela se desevolveu ameaçado por outras atividades que ão codizem com a realidade e aptidões regioais (VEIGA, 2011). Diate do apresetado o presete trabalho tem como objetivo geral idetificar possíveis polimorfismos o gee IGF-I em aimais da raça Crioula Lageaa buscado viabilizar uma ferrameta aplicável, em termos populacioais, com vistas ao melhorameto geético da raça e da espécie em geral. 2. Material e métodos 2.1. Coleta e preparação das amostras Neste trabalho, foram cosideradas amostras de DNA obtidas dos folículos pilosos da cauda de 63 aimais da raça Crioula Lageaa pertecetes às propriedades localizadas a região do muicípio de Lages/SC, os aos de 2015 e As amostras foram coletadas da vassoura da cauda dos aimais adequadamete cotidos o troco. O excesso dos pelos de cada amostra foi cortado com tesoura e fios de cerca de 5 cm cotedo os folículos pilosos foram acodicioados e devidamete idetificados em sacos plásticos. Na preparação das amostras para posterior extração do DNA, foram cortados cerca de 40 folículos por aimal, colocados em microtubos estéreis de 1,5 ml, idetificados e armazeados em freezer -20 C até o mometo da extração do DNA geômico Aálises laboratoriais Todas as aálises laboratoriais do presete trabalho foram desevolvidas o Laboratório de Esio e Pesquisa em Geética Aimal (LEPGA), o Cetro de Ciêcias Agrárias da Uiversidade Federal de Sata Cataria, em Floriaópolis/SC. Extração de DNA geômico A extração do DNA geômico foi realizada utilizado o método feol-clorofórmioálcool isoamílico, adaptado de Lima (2003). Detro de cada microtubo de 1,5 ml cotedo os folículos foram adicioados 500 µl de solução TE-TWEEN [Tris 50 mm, EDTA (ácido etileo diamio tetra-acético), 1 mm, 0,5% Twee 20] e as amostras permaeceram icubadas em baho-maria a 65ºC por 1 hora e 30 miutos com agitação maual periódica. Posteriormete foram adicioados 7 µl de proteiase K (20 µg/µl) icubado-se as amostras a 55ºC por 6 horas realizado agitação por iversão a cada 30 miutos, depois as amostras foram matidas em baho-maria a 37ºC por uma oite. Após esta etapa, foi adicioado 1 volume de solução PCI (feol-clorifórmio-álcool isoamílico 25:24:1) para 1 volume de amostra e os tubos passaram por vigorosa agitação por 10 segudos em agitador automático tipo vórtex. Em seguida foi feita cetrifugação a rpm por 10 miutos a 23ºC, sedo o sobreadate trasferido para um ovo tubo devidamete idetificado, resultado em um volume fial de aproximadamete 300 µl. A precipitação do DNA foi feita com acetato de sódio 0,3 M a quatia de 1/10 do volume da amostra (cerca de 30 µl) e etaol absoluto gelado (1000 µl), sedo feita a mistura por iversão seguida de repouso durate 1 hora e 30 miutos a -20 C para etão realizar uma cetrifugação a rpm por 25 miutos a 4ºC. Fialmete foi descartado o sobreadate, sedo o DNA remaescete seco a temperatura ambiete e em seguida resuspedido em 100 µl de água ultra pura e armazeado a 4ºC até o uso as aálises subsequetes. Para verificar a eficiêcia da metodologia da extração as amostras foram misturadas a 3 µl de tampão de corrida (azul de bromofeol, xileo-cyaol e glicerol) submetidas à eletroforese em gel de agarose (0,5%) com brometo de etídio, em tampão TBE 1X (Tris-HCl 89 mm; EDTA 2,5 mm e Ácido Bórico 89 mm e ph 8,3) a 50V, por aproximadamete 50 miutos. A visualização foi feita sob luz ultravioleta em Sistema de Fotodocumetação L-Pix EX (Loccus Biotecologia) e as images dos géis foram registradas com auxílio do software L-Pix Imagem Ex Reação de Amplificação de DNA por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Foi desehado um par de primers para amplificar uma região de aproximadamete 800 pares de bases correspodete à parte do Itro 4, Exo 5 e parte do Itro 5 do gee 5 do IGF-I bovio. Para desehar os primers utilizaram-se iformações de sequêcias dispoíveis o GeBak (https://www.cbi.lm.ih.gov/gebak/) (HG ; HG ; HG ; HG ; HG ; HG ; HG ; HG ). As sequêcias de ucleotídeos desehadas foram: IGF-I Forward 5 - CCT CAC CTG AAT GCG AGC C - 3, IGF-I - Reverse 5 - ATG TAC TGT GCG CCT CTC AA - 3. As reações de PCR foram feitas com volume fial de 25 µl/amostra o qual cotiha aproximadamete 100 g de DNA geômico, 0,5 µm de cada primer, tampão PCR 1X, 100 µm de dntps, 0,5 U de EqsyTaq DNA Polymerase (Tras Ge Biotech). A reação foi coduzida em termociclador Biometra, os ciclos de amplificação seguiram a seguite programação: 95ºC por 1 miuto para desaturação, 56,8ºC por 1 miuto para aelameto dos primers, 72ºC por 1 miuto para extesão. Os ciclos foram repetidos 35 vezes e, após o térmio, as amostras foram matidas a 4º C. Para verificar o resultado da PCR uma alíquota de 5 µl de cada amostra foi misturada a 3µL de tampão de corrida (azul de bromofeol, xileo-cyaol e glicerol) e submetida à eletroforese em gel de agarose a 1,0% com brometo de etídio (0,05 µg/ml), utilizado tampão TBE 1X a 70V por aproximadamete 1 hora e 10 miutos. O gel foi visualizado sob luz ultravioleta em Sistema de Fotodocumetação L-Pix EX (Loccus Biotecologia) e as images foram registradas com auxílio do software L-Pix Imagem Ex Técica de RFLP (Restrictio Fragmet Legth Polymorphism) Após o isolameto e a amplificação da região de iteresse do gee do IGF-I pela PCR, as amostras foram submetidos à técica de RFLP, que cosiste a clivagem da molécula do DNA por ezimas de restrição, em sequêcias cohecidas que possuem geralmete de 4 a 6 ucleotídeos. A difereça de um par de bases etre os idivíduos pode criar ou extiguir um sítio de restrição em um determiado locus do geoma, gerado um polimorfismo. Dessa forma, se o DNA for digerido com a ezima de restrição adequada, o locus polimórfico pode ser idetificado pela mudaça o tamaho do fragmeto do DNA (REGITANO e COUTINHO, 2001). Neste trabalho, a aplicação da técica de RFLP para tetar idetificar polimorfismos foi realizada utilizado-se a ezima de restrição Hif-I (Ivitroge) cuja sequêcia palidrômica do sítio de clivagem é 5 - G ANT C- 3, 3 - C TNA G - 5. As digestões 6 foram realizadas em volume fial de 20 µl/amostra, cotedo 10 µl do produto da PCR, 1/10 de tampão para ezima de restrição e 5 uidades da ezima Hif-I. O procedimeto foi realizado em termociclador Biometra, a digestão foi feita por 3 horas a 37 C depois 25 miutos a 70 C para iativação da ezima e fialmete 4 C para coservação das amostras até a aálise. Para visualização do resultado 10µl de cada amostra foram misturados a 5µl de tampão de corrida (azul de bromofeol, xileo-cyaol e glicerol) para realização da eletroforese em gel de agarose (2,0%) com brometo de etídio (0,05 µg/ml), em tampão TBE 1X a 100V, por 1 hora e 10 miutos. A visualização do padrão eletroforético de migração das badas ocorreu sob luz ultravioleta em Sistema de Fotodocumetação L-Pix EX (Loccus Biotecologia) e as images foram registradas com auxílio do software L- Pix Imagem Ex Cálculos de frequêcias e teste de equilíbrio de Hardy e Weiberg As frequêcias gêicas (x i e x j ) e geotípicas (x ii, x ij e x jj ) obtidas foram determiadas a partir da cotagem direta dos geótipos observados e estabelecidas com as seguites equações: x i ii (0,5 ij ) x j jj (0,5 ij ) x ii ii x ij ij x jj Ode: ii, jj e ij correspodem ao úmero de homozigotos e heterozigotos observados os alelos i e j, respectivamete; correspode ao úmero de idivíduos aalisados. Para testar a aderêcia das frequêcias observadas ao equilíbrio de Hardy-Weiberg, foi utilizado o software estatístico GENEPOP versão 3.1 (RAYMOND e ROUSSET, 1995). As frequêcias geotípicas esperadas, em equilíbrio, foram estimadas a partir da expasão do biômio descrito por Falcoer e Mckay (1996): ( xi x j ) xi 2xi x j x j jj 7 Em que: 2 x i = frequêcia esperada dos homozigotos para o alelo i; 2x i x j = frequêcia esperada para heterozigotos ij; 2 x j = frequêcia esperada dos homozigotos para o alelo j. 3. Resultados e discussão O procedimeto usado para extração do DNA geômico dos folículos pilosos dos bovios mostrou-se eficiete como mostra a imagem foto documetada do gel (Figura1) a qual a primeira bada formada o padrão de migração mostra uma quatidade satisfatória de DNA extraído. Cotudo a grade maioria das amostras apresetaram badas arrastadas o que sugere siais de degradação do DNA e a bada formada o fim do padrão e fortemete visível idica RNA (SALMAM e LAUREANO, 2006). Etretato, a preseça de RNA e DNA degradado ão comprometeu as aálises posteriores de PCR e RFLP. Figura 1. Exemplo de amostras de DNA extraído. Eletroforese em gel de agarose a 0,5%. Para defiir a melhor temperatura de aelameto dos primers foi realizado um teste de gradiete de temperatura usado 3 qualidades de amostras de DNA, A: boa, B: regular C: ruim. O gradiete utilizado foi de 51 a 56,8 C. Não ocorreu amplificação da amostra C (ruim) o que idica a iexistêcia ou isuficiêcia de DNA esta. Já as amostras viáveis, A e B, observaram-se melhores resultados as temperaturas mais elevadas devido à meor formação de badas iespecíficas (Figura 2). 8 Figura 2. Teste de gradiete de temperatura para aelameto dos primers. Eletroforese em gel de agarose a 1%. O resultado da PCR foi satisfatório apresetado uma bada bem defiida com o fragmeto do tamaho esperado de aproximadamete 800pb, idicado o fucioameto dos primers desehados para a região estudada (Figura 3). Figura 3. Resultado da PCR com idicação do fragmeto do gee do hormôio IGF-I amplificado Eletroforese em gel de agarose 2%. Os fragmetos amplificados a PCR posteriormete digeridos pela ezima Hif-I a técica de RFLP permitiram, após a eletroforese em gel de agarose, a idetificação de 3 padrões de migração das badas distitos: dois homozigotos (VV, SS) e um heterozigoto (VS), coforme ilustra a Figura 4. Tal resultado caracteriza a existêcia de polimorfismo a reg
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