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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE EOSINÓFILOS E PROTEÍNA CATIÔNICA EOSINOFÍLICA NA URINA: UMA NOVA ABORDAGEM PARA O DIAGNÓSTICO DA INFLAMAÇÃO RENAL NO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO TEREZA NEUMA DE SOUZA BRITO NATAL/RN 2011 TEREZA NEUMA DE SOUZA BRITO EOSINÓFILOS E PROTEÍNA CATIÔNICA EOSINOFÍLICA NA URINA: UMA NOVA ABORDAGEM PARA O DIAGNÓSTICO DA INFLAMAÇÃO RENAL NO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de doutor em Ciências da Saúde ORIENTADORA: PROFA. DRA. VALÉRIA SORAYA DE FARIAS SALES CO-ORIENTADORA: PROFA. DRA. MARIA JOSÉ PEREIRA VILAR NATAL/RN 2011 ii B862e Catalogação da publicação na fonte Brito, Tereza Neuma de Souza. Eosinófilos e proteína catiônica eosinofílica na urina: uma nova abordagem para o diagnóstico da inflamação renal no lúpus eritematoso sistêmico / Tereza Neuma de Souza Brito. Natal/RN, f.: il. Orientadora: Profª Drª Valéria Soraya de Farias Sales. Co-orientadora: Profª Drª Maria José Pereira Vilar. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. 1. Eosinófilos Tese. 2. Proteína catiônica eosinofílica Tese. 3. Lúpus eritematoso sistêmico Tese. I. Sales, Valéria Soraya de Farias. II. Vilar, Maria José Pereira. III. Título. UFRN/BSCCS CDU: iii UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE COORDENADORA: PROFA. DRA. TÉCIA MARIA DE OLIVEIRA MARANHÃO iv TEREZA NEUMA DE SOUZA BRITO EOSINÓFILOS E PROTEÍNA CATIÔNICA EOSINOFÍLICA NA URINA: UMA NOVA ABORDAGEM PARA O DIAGNÓSTICO DA INFLAMAÇÃO RENAL NO LÚPUS ERITEMATOSO SISTÊMICO BANCA EXAMINADORA: Presidente da Banca Profa. Dra.Valéria Soraya de Farias Sales UFRN Membros da Banca Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales - UFRN Prof. Dr. Max Victor Carioca Freitas - Externo Profa. Dra. Profa. Dra. Amália Cinthia Meneses do Rego - Externo Prof. Dr. Maurício Galvão Pereira - UFRN Prof. Dra. Elaine Lira Medeiros Bezerra - UFRN Aprovada: 28 de novembro de 2011 v Sei que meu trabalho é uma gota no oceano, mas sem ele o oceano seria menor. (Madre Teresa de Calcutá) vi DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a... Deus, por ter me dado força, fé, sabedoria e esperança para ser perseverante e alcançar com as suas bênçãos mais uma vitória em minha vida. Pelo amor incondicional, sem limites... Meu marido Ribamar e a meus filhos Ana Luiza e André Luiz, razões maiores da minha vida..., a meu genro João Luis e a nora Albirea Shinobu Por toda paciência, amor, esforços desmedidos, orientações e força que me fazem forte e pelo exemplo diário de como se deve constituir uma família. vii AGRADECIMENTOS Aos pacientes, pela disponibilidade e pela lição de incentivo, apesar de toda a sintomatologia da doença, não se negaram em participar da pesquisa. Ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde pela oportunidade de realizar esse trabalho e pelos conhecimentos adquiridos durante todo este periodo. A minha orientadora, Prof a Dr a Valéria Soraya de Farias Sales primeiramente por ter aceitado me orientar, pelos ensinamentos em imunologia, pela amizade, companheirismo e pelo apoio. A minha co-orientadora Prof a Dr a Maria José Pereira Vilar, obrigada pela disposição em ajudar, discutir e ensinar. Sua participação foi fundamental para o desenvolvimento desse trabalho. A Dr José Bruno Almeida pelo apoio e incentivo constantes para que se faça uma Uroanálise de qualidade e pelas correções e sugestões no trabalho. A Maria do Carmo Cardoso de Medeiros (Carminha) pelos ensinamentos e ajuda na imunofluorescência. A Juliana Cavalcante e Dra. Luiza Karla P. Arruda (USP-RP) pela grande ajuda na realização das dosagens da ECP. A todas as pós-graduandas do laboratório de imunologia clínica pela grande ajuda nas fosforilações da imunologia, pelas cytokines e também pela amizade. Ao Departamento de Análises Clinicas e Toxicológicas, especialmente a chefia (Telma Maria de Araújo Moura Lemos), a secretaria (Asinete, Maria José, Seu Josias e viii Mikelison) e ao pessoal da sala de coleta (Giliane Lemos, Lúcia Jacinto, Ana Júlia e Alexandro) que não mediram esforços para ajudar no trabalho. Aos funcionários: do HUOL, Virtolino Neto, Oscar e Elisângela, pela ajuda na coleta e transporte das amostras até o laboratório. A Dona Amélia Silva de Morais e Evanilda Lopes da Silva, do DACT, pelo cuidado em manter todo o laboratório sempre pronto para realização das análises. Vocês foram fundamentais para que as análises fossem corretas. Aos residentes da enfermaria de reumatologia pela ajuda no preenchimento do protocolo clínico e do Mex-SLEDAI. Aos meus amigos e colegas farmacêuticos Zélia Maria de Sousa (Zelinha), Edna Marques de Araújo Silva, Maria Goretti do Nascimento Santos, Geraldo Barroso C. Júnior, Ana Claúdia Galvão Freire Gouveia, Sandra Resende de Andrade, Ivanaldo Amâncio da Silveira, Maiza Rocha Abrantes, Elizabeth (Eliuza), Tatiana Xavier e Ivonete Batista de Araújo pela torcida e pela ajuda intelectual e espiritual constantes e também por dividir comigo as angústias dessa etapa da vida. A Vivian Silbiger e André Luchesi pela ajuda na organização do artigo e nas dúvidas de informática. Aos professores e colegas da Bioquímica Clínica e da Uroanálise pelo incentivo e apoio.. E, finalmente, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para que eu chegasse até aqui. ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACR - American College of Rheumatology AIN - Acute interstitial nephritis Anti-dsDNA - Anti-double-stranded DNA AUC Área sob a curva CEP- Comitê de Ética em Pesquisa, C3 e C4- complementos 3 e 4 Cr - Creatinina ECP - Proteína Catiônica Eosinofílica EDN - Neurotoxina Derivada do Eosinófilo egfr - Estimated glomerular filtration rate EPO - Peroxidase do Eosinófilo EPX - Proteína X do eosinófilo FEIA - Fluoroenzymeimmunoassay GM-CSF - Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos HPF - High power field HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes IFN-γ - Interferon-γ IL-5 Interleucina 5 IQR Range Interquartílico kda Quilo Daltons LES Lúpus Eritematoso Sistêmico LN Nefrite lúpica x LTC4 e LTD4 Leucotrieno 4 MCP - Proteínas quimioatrentes de monócitos MEX-SLEDAI - Mexican version of the SLE Disease Activity Index Mg - Miligrama MIP-1α - Proteína inflamatória do macrófago NIA Nefrite Intersticial Aguda PAF - Fator ativador de plaquetas Pg - Picograma Pr - Proteína RNase A Ribonuclease A ROC - Receiver operating characteristic SD Desvio Padrão SLE Systemic lupus erythematosus TGF α/β - Fator de transformação do crescimento TNF-α - Fator de necrose tumoral uecp - Proteína Catiônica Eosinofílica Urinária UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte VIP - Peptídeo vasoativo intestinal WHO - World Health Organization µg - Micrograma xi LISTA DE TABELAS Artigo 1 Table 1: Baseline characteristics and laboratory parameters observed for select patients per group, of all SLE patients included (n=74). Table 2: Laboratory values for 74 SLE subjects with and without renal disease. Table 3: Results of correlation between variables of the study and laboratory results that evaluate the involvement of renal function and disease activity in SLE. Table 4: Results of the ROC curve analyses using SLE patients with and without lupus nephritis to detect cut-off levels of eosinophiluria, urine ECP and ECP/Cr ratio. xii LISTA DE FIGURAS Artigo 1 Figure 1: Eosinophiluria by Hansel s stain (400X) (arrow). Figure 2: Curve of receiver operating characteristic (ROC) in SLE patients to detect cutoff of eosinophiluria, uecp and uecp-cr ratio, classified by state variables Pr/Cr ratio 2 (A) and egfr 60 ml/min (B): Artigo 2 Figure 1: Eosinophils in urine samples of the patients lupus nephritis, Hansel s stain. Urinalysis Discipline file of the Department of Clinical and Toxicological Analyses-UFRN, Natal. xiii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 16 2 REVISÃO DA LITERATURA 18 3 ANEXAÇÃO DE ARTIGOS ARTIGO 1.Resumo expandido Abstract ARTIGO Abstract Introdution Patients and methods Results Discussion Key Messages Acknowledgements References 42 4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES 51 5 APÊNDICES 56 6 ANEXOS Anexo 1 Protocolo clínico Anexo 2 Mex-SLEDAI Anexo 3 - Parecer do Comitê de Ética REFERÊNCIAS 60 xiv RESUMO O objetivo desse trabalho foi investigar o eosinófilo e a proteína catiônica eosinofílica (ECP) na urina de pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), com e sem nefrite lúpica, como possíveis marcadores de inflamação renal. Foram estudados 74 pacientes com LES 20 com evidência clínica e laboratorial de nefrite lúpica (LN grupo) e 54 sem envolvimento renal (não-ln grupo) quanto à eosinofilúria e ECP urinária (uecp). A eosinofilúria foi observada através da coloração de Hansel e as concentrações de ECP urinária foram obtidas por fluoroenzimaimunoensaio e em seguida corrigidas pela creatinina urinária (uecp/ucr). As variáveis do estudo foram comparadas com a hematúria glomerular, relação proteína/creatinina urinária (upr/ucr), creatinina sérica, clearance de creatinina estimado, anti-dsdna, níveis séricos dos complementos C3 e C4, relação IL-5 urinária/creatinina e com o Índice de atividade da doença LES (Mex-SLEDAI). A avaliação preditiva da eosinofilúria e uecp foi observada através da curva ROC e o nível de significância do estudo foi p valor 0,05. Os resultados mostraram que a eosinofilúria e as concentrações da uecp e uecp/ucr foram mais elevadas nos pacientes do LN grupo em relação ao não-ln grupo (p 0,001 para todos). Essas variáveis mostraram uma correlação estatisticamente significativa com a hematúria, dismorfismo eritrocitário glomerular, cilindrúria, relação upr/ucr, creatinina sérica, clearance de creatinina estimado, anti-dsdna, relação IL-5 urinária/creatinina e com o Mex-SLEDAI (p 0,05). Os resultados da curva ROC mostraram uma melhor performance (área sob a curva-auc) para a uecp/ucr, usando como variável de classificação a upr/ucr (AUC=0,94) e o clearance de creatinina estimado (AUC=0,84), p 0,0001. Conclui-se que dentre as variáveis do estudo, a uecp/ucr pode servir como um novo marcador de inflamação renal em pacientes com LES. Palavras Chave: Eosinófilos. Proteína catiônica eosinofílica. Lúpus Eritematoso Sistêmico xv 1 INTRODUÇÃO O Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) é uma doença autoimune, multifatorial caracterizada pela produção de auto-anticorpos, formação de imunocomplexos e inflamação em diferentes órgãos, sendo o rim um dos órgãos mais afetados. Sua patogênese é desencadeada tanto por fatores genéticos, ambientais e hormônios sexuais quanto por anormalidades do sistema imune inato e adaptativo. A ativação anormal de células T, B e células apresentadoras de antígenos tem como resultado final a produção dos auto-anticorpos patogênicos altamente específicos, a ativação do sistema complemento e a presença de células inflamatórias em órgãos-alvo [1-4]. Dentre as células envolvidas na fisiopatologia de inúmeros processos inflamatórios estão os eosinófilos, que são recrutadas para o local da inflamação onde modulam a resposta imune inata e adaptativa através de uma série de mecanismos, tais como secreção de proteínas catiônicas, citocinas próinflamatórias, quimiocinas, mediadores lipídicos e expressão de receptores para citocinas, imunoglobulinas, complemento, dentre outros [5-7]. A análise de células urinárias refletindo a inflamação renal no LES pode ser uma ferramenta útil no monitoramento da doença renal [8]. A eosinofilúria pode refletir uma resposta inflamatória não específica, mas a sua investigação tem sido associada a várias condições clínicas que afetam os rins e o trato urinário, especialmente os casos de nefrite intersticial aguda (NIA) induzida por fármacos [9-11]. 16 A proteína catiônica eosinofílica (ECP) vem sendo estudada como marcador em processos inflamatórios do trato respiratório, dermatite atópica e outras doenças inflamatórias [12], mas no LES não foi encontrado relato na literatura. Com base nos achados de eosinófilos na urina de pacientes com LES, doença autoimune de alta incidência aqui no Rio Grande do Norte [13] e no papel importante dos eosinófilos nas doenças inflamatórias, foi proposto esse estudo com o objetivo de avaliar a eosinofilúria e a concentração da ECP urinária em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico, com e sem nefrite lúpica, como um possível marcador de inflamação renal. 17 2 REVISÃO DA LITERATURA Estudos epidemiológicos de prevalência e incidência de LES em todo o mundo apresentam resultados bem variáveis. A incidência está na faixa de 1 a 10/ habitantes/ano e a prevalência de 16 a 70/ habitantes/ano. Acomete mais predominantemente as mulheres, entre 20 e 30 anos de idade [14]. No Brasil, particularmente no Nordeste, na cidade de Natal onde a exposição aos raios ultravioletas é intensa, a incidência é de 8,7/ habitantes [13]. O envolvimento renal no LES ocorre em aproximadamente 25 a 60% dos pacientes e tem um espectro de severidade muito variado podendo evoluir, em cerca de 10 a 15%, para uma doença renal terminal, a qual contribui significativamente para morbidade e mortalidade desses pacientes. A biópsia renal é o padrão ouro para classificar o tipo histológico de nefrite, no entanto, como é um procedimento invasivo e com riscos de hemorragia e infecção, não é uma metodologia satisfatória para monitorar o envolvimento renal, que exige um monitoramento de longo prazo. O advento da precisão de biomarcadores para prever, diagnosticar e monitorar a nefrite lúpica será uma grande conquista na ajuda aos pacientes com LES [15-19]. Estudos sobre a patogênese da nefrite lúpica mostram uma interação entre as células do parênquima renal e células inflamatórias recrutadas devido à deposição glomerular de imunocomplexos e ao desequilíbrio na homeostase das citocinas. Na literatura existe considerável evidência para o papel de células T helper 1(Th1), T helper 17 (Th17) e células T reguladoras (treg) no LES, porém 18 diversos estudos tem sugerido uma possível contribuição das células T helper (Th2). Foi observado que os imunocomplexos são constituídos por imunoglobulinas IgM, IgG e IgA bem como por IgE e já foi constadada a presença de IgE auto-reativa no soro de alguns pacientes com LES sem associação à atopia e alergia [20-22]. Dentre as células que desempenham importante papel na resposta Th2, o eosinófilo, que é um leucócito multifuncional das doenças alérgicas, parasitárias e que participa no reparo do tecido vem sendo apontado como uma célula envolvida na modulação da resposta imune inata e adquirida [23]. O eosinófilo é também um componente do microambiente imune local, tem atividade autócrina e quando ativado secreta para o local da inflamação, proteínas citotóxicas, presentes em seus grânulos secretórios secundários ou específicos. São elas, a Proteína Básica Principal (MPB), Proteína Catiônica Eosinofílica (ECP), Neurotoxina Derivada do Eosinófilo/Proteína X do eosinófilo (EDN/EPX) e a Peroxidase do Eosinófilo (EPO) [5-7, 23]. Além das proteínas catiônicas, o eosinófilo também secreta as interleucinas, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, fator de transformação do crescimento (TGF α/β), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interferonγ (IFN-γ)], mediadores lipídicos como o leucotrieno 4 (LTC4 e LTD4) e fator ativador de plaquetas (PAF). Nos grânulos eosinofílicos, além da síntese e armazenamento dessas citocinas há também a síntese e armazenamento de quimiocinas como as pertencentes à família das eotaxinas 1, 2 e 3, a proteína 19 inflamatória do macrófago (MIP-1α), a RANTES, proteínas quimioatrentes de monócitos MCP 3 e 4, a substância P e o peptídeo vasoativo intestinal (VIP) [5, 6, 23]. A Proteína Catiônica Eosinofílica (ECP), é uma glicoproteína com peso molecular entre 18 e 21 kda, pertencente à superfamília das ribonucleases A (RNase A). Corresponde a cerca de 30% das proteínas dos grânulos do eosinófilo e está envolvida na resposta imune. As concentrações de ECP nos fluidos biológicos indicam a ativação e degranulação do eosinófilo e são usadas para o diagnóstico e monitoramento de doenças inflamatórias [12, 24-26]. A presença de eosinófilos na urina foi primeiramente sugerida por Galpin e colaboradores (1978), que acharam essa célula na urina em nove pacientes que tinham nefrite intersticial aguda induzida por meticilina e não encontraram em outros pacientes com deficiência renal por outras causas. [27] A eosinofilúria pode refletir uma resposta inflamatória não específica, mas a sua investigação tem sido associada a várias condições clínicas que afetam os rins e o trato urinário, especialmente os casos de nefrite intersticial aguda (NIA) induzida por fármacos [9-11]. A análise das proteínas catiônicas do eosinófilo na urina, realizada em pacientes com tumores na bexiga sugeriu que a ECP, por não ser filtrada no glomérulo renal, quando encontrada na urina, poderia refletir atividade eosinofílica local no trato urinário e mostrou sua importância no diagnóstico de neoplasia urotelial, tanto como valor preditivo de prognóstico quanto no acompanhamento da terapia [28]. 20 A variação circadiana da ECP sérica e da EPX sérica e urinária foi analisada e mostrou níveis máximos dessas proteínas durante a noite e no período matinal. Isto sugere que estudos de marcadores inflamatórios no sangue e na urina devem ser realizados para validação e que os marcadores inflamatórios não exibem apenas uma variação circadiana, mas também podem sofrer influências das variações sazonais e espontâneas do dia-a-dia [29]. A presença de eosinofilúria e detecção da ECP, em extratos de urina foram evidenciadas em crianças escolares da Tanzânia infectados pelo Schistosoma haematobium e que apresentavam alterações patológicas na bexiga [24]. Em uma experiência com 183 pacientes com diversas condições clínicas, sendo as mais comuns, infecção do trato urinário e nefrite intersticial aguda, que tiveram suas urinas testadas para eosinofilúria, utilizando a coloração de Hansel, foi constatado, que a mesma é um bom indicador de NIA [10]. Estudo em 148 pacientes, dos quais 44 apresentavam diagnóstico de comprometimento do trato genitourinário com presença de leucócitos na urina foi encontrado eosinofilúria em 9 pacientes na proporção de 1/500 a 1/100 e em 2 pacientes valores superiores a 1/100. De 15 pacientes com NIA, 6 tinham eosinofilúria positiva acima de 1/100 e em 36 pacientes com outras falhas renais, dez apresentavam positividade acima de 1/100 [30]. Marcadores de comprometimento renal no LES como sedimento urinário ativo, creatinina sérica, albumina sérica e excreção urinária de proteína (relação proteína/creatinina, coleta de proteína na urina cronometrada, clearance de creatinina estimado) são os mais utilizados rotineiramente. No entanto, sabe-se 21 que essas medidas nem sempre podem distinguir com precisão entre a inflamação ativa e os danos renais crônicos, por isso novos biomarcadores vem sendo pesquisados na urina e dentre eles destacam-se as proteínas, citocinas, moléculas de adesão e quimiocinas, que podem ser úteis e mostram ser uma potencial ferramenta laboratorial para avaliar o rim. As medições urinárias podem também refletir uma medida do grau de disfunção tubular, ao invés de refletir apenas a patologia glomerular [31]. 22 3 ANEXAÇÃO DE ARTIGOS Artigo 1: Resumo Expandido: Publicado: Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Volume 46, Pages: S689 S772, ISSN (Online) , August Published Online: August Impact Factor: 1,89 Artigo 2- Enviado para publicação em 07 de setembro de 2011 no periódico Rheumatology e recebeu o número RHE Periódico: Rheumatology ISSN ISI Impact Factor: Artigo 1 Title EOSINOPHILURIA: FINDINGS FREQUENT OR SPORADIC? Freire S.A.V.1, Oliveira T.V.C. 1, Silva
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