Economy & Finance

MEJORAMIENTO DE CEPAS INDUSTRIALES

Description
MEJORAMIENTO DE CEPAS INDUSTRIALES
Published
of 7
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Related Documents
Share
Transcript
  Universidad Nacional de Cajamarca Facultad Ciencias Agrarias E.A.P. Ingeniería de industrias alimentarias MEJORAMIENTO DE CEPAS INDUSTRIALES I.   INTRODUCCIÓN: Mejoramiento de microorganismos industriales En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metabolitos de interés industrial  producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tanto se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los  procesos. Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimización del medio de cultivo y de las condiciones de operación, pero esto está limitado  por la capacidad de síntesis máxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidad es el mejoramiento genético de la cepa. Como ya se dijo, la productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos. Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr nuevamente la máxima productividad. Por lo tanto los  programas de desarrollo involucran una continua modificación genética del microorganismo, seguida por una readaptación del medio de cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operación y también de los procesos de extracción y purificación. II.   MARCO TEÓRICO: La obtención de cepas modificadas genéticamente se puede realizar por: Selección natural de variantes. Mutación inducida. Recombinación genética  2.1.SELECCIÓN NATURAL DE VARIANTES: Se debe tener en cuenta que en cada división celular hay una pequeña probabilidad de que ocurra un cambio genético, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la población sea heterogénea. Esta distribución puede presentar  problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienen menores niveles de producción que la población parental. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotípicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las células de la población que expresan la misma modificación fisiológica, dentro de las variaciones  permitidas por su genotipo. En las mutaciones espontáneas el elemento responsable de la mutación no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagénico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadísticamente medible (tasa de mutación). La frecuencia de mutaciones espontáneas varía entre 10 - 6 a 10-9 mutaciones por genoma y por generación. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7 se deberán estudiar un gran número de organismos (> 10 7 ) en la búsqueda del tipo deseado. En la selección de variantes naturales, una práctica que todavía es utilizada se refiere a la observación de las características morfológicas de las colonias, las cuales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor  productividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados. Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos  Universidad Nacional de Cajamarca Facultad Ciencias Agrarias E.A.P. Ingeniería de industrias alimentarias de evaluación del producto. En estos casos es más adecuado realizar las experiencias en erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en tubos o pequeños frascos son menos confiables. A veces es posible el diseño de un procedimiento simple de "screening" selectivo  para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, células no mutadas que mueren en un plaqueo por selección de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aíslan mutantes con un esfuerzo mínimo aún de poblaciones donde la tasa de mutación es menor a 1 x 106. Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la luz ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el mencionado los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mutación. 2.2.MUTACIÓN INDUCIDA: El procedimiento de mutación mediante el empleo de un agente determinado implica dos etapas, el tratamiento de la población con el mutágeno elegido y luego el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y selección. Empíricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento de distintos "espectros" de mutantes. La elección de un agente mutagénico depende en general de consideraciones  prácticas. En algunos de los casos es más conveniente el empleo de más de uno en lugar del uso masivo de uno solo. La técnica a emplear puede producir una alta tasa de mutación o puede favorecer la separación de un número reducido de tipos deseables de un gran número de productores mediocres. Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debería utilizar la característica mejorada del mismo como factor de selección. El incremento de su  productividad podría ser el resultado de una modificación en los mecanismos de control que limitan el nivel de producción y/o de una variación en los precursores que llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y mecanismos de control de la biosíntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir en el aislamiento. Es importante en los programas de búsqueda y selección, tener una alta proporción de mutantes entre la población sobreviviente al tratamiento, debido a que sólo estos individuos son los estudiados. Con el aumento de la dosis del mutágeno en general se incrementa esta proporción, aunque para cada mutágeno y cada organismo hay una dosis óptima. Los agentes mutagónicos pueden ser agrupados en: 1)   Físicos:  Como la luz ultravioleta, que es un mutágeno muy conveniente. La longitud de onda puede variar de 200 a 300 nm y el tiempo de exposición entre 0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lograr un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X y rayos v son actualmente poco utilizados. 2)   Químicos:  Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de 0.05 M con exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no  Universidad Nacional de Cajamarca Facultad Ciencias Agrarias E.A.P. Ingeniería de industrias alimentarias tóxicos, el grado de mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se realiza adicionando el mutágeno a una suspensión de células, la cual es incubada a temperatura constante un determinado tiempo. 2.3.RECOMBINACIÓN GENÉTICA: El mejoramiento de una cepa industrial empleando técnicas de mutagénesis selección conduce a la creación de líneas divergentes. Una estrategia más lógica en tal programa de mejoramiento sería reagrupar las potencialidades de distintas variantes con el objeto de seleccionar la mejor combinación de genes responsables de codificar la producción de determinado metabolito.A partir de 1977 con los trabajos de Hopwood se muestra que es  posible lograr la recombinación genética, definiendo por tal a cualquier proceso que genere nuevas combinaciones de genes los cuales estaban srcinalmente en individuos diferentes. Todos los procesos no meióticos en células vegetativas que llevan a recombinación son llamados parasexuales y aparecen tanto en organismos procariotes como eucariotes. Los virus pueden intercambiar material genético entre cepas heterogénicas después de una infección mixta en el mismo huésped. En bacterias el fenómeno de recombinación se observa en: 1)   Conjugación:  En donde la transferencia de material genético se realiza a través de pilis, teniendo algunas características de un proceso sexual 2)   Transducción:  En el que la transferencia de ADN de una célula a otra se realiza mediante una partícula viral que actúa como vector. 3)   Transformación:  Donde la recombinación puede ocurrir después de la inserción experimental de un ADN aislado, a una bacteria receptora.   El intercambio de material genético entre diferentes especies puede también ser alcanzado  por fusión celular. El primer paso en este caso es la preparación de protoplastos, los cuales son células que han perdido su pared celular externa y son limitadas solamente por su membrana. Se los prepara sometiendo una suspensión celular a la acción de enzimas degradativas de la pared (lisozima) en un medio isotónico, para minimizar la ruptura por efectos osmóticos. Los protoplastos de los cultivos que se desea fusionar, son mezclados y fusionados en presencia de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfóxido en algunos casos, luego de lo cual se los siembra rápidamente en un medio completo para regenerar las células. La incubación de protoplastos resulta en regeneración de la pared celular y reversión a una célula de morfología normal, lo cual es una propiedad crítica, ya que después de la fusión se desea recuperar un organismo, el cual pueda ser cultivado normalmente en pequeña y gran escala. La fusión celular es seguida por fusión nuclear. La técnica de fusión celular se emplea en la obtención de hibridomas que son células que se obtienen por fusión de linfocitos con células de mieloma (cáncer de piel) de ratón u otro animal. Cada célula de hibridoma sintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este tipo de células produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una enorme importancia en reactivos de diagnóstico, en la purificación de moléculas por su alta afinidad específica y como vectores de drogas u otros reactivos para combatir tumores.  Universidad Nacional de Cajamarca Facultad Ciencias Agrarias E.A.P. Ingeniería de industrias alimentarias 3.   MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y TÉCNICAS PARA DETERMINAR LA POBLACIÓN MICROBIANA Los microorganismos pueden ser aislados y propagados por diferentes métodos: su utilización varía según el propósito y tipo de microorganismo que se deseen aislar. Para su identificación se utilizan diferentes métodos como son el estudio de su morfología que también incluye sus reacciones frente a diferentes colorantes y el tipo de estructura que pueden poseer como endosporas, cápsula, etc. Así mismos son de gran utilidad sus productos metabólicos ya que muchos de estos son típicos para cada especie y pueden ser utilizados para su identificación; estas sustancias metabólicas pueden ser detectadas por medio de una serie de pruebas que se conocen como reacciones  bioquímicas. Para cualquiera de los casos anteriores (morfología, coloración o reacción bioquímica) se necesitan medios de cultivo adecuadamente seleccionados, preparados y almacenados. Independientemente de los medios de cultivo y métodos utilizados, el éxito del trabajo en el laboratorio de microbiología depende de la adecuada elección y buen uso de los métodos de esterilización y técnicas asépticas. El estudio de los microorganismos lleva consigo la utilización de una amplia gama de medios de cultivo tanto líquidos como sólidos pero previamente es necesario obtener cultivos puros de aquellos. Cualquier inoculo primario contendrá probablemente varios tipos distintos de microorganismos que darán lugar a un cultivo mixto. Efectuando una cuidadosa inoculación en un medio sólido en placa de cultivo se obtienen colonias separadas de cada microorganismo presente, cada una de las cuales procede en la mayoría de los casos de la multiplicación de un solo microorganismo. Una sola célula da srcen a una población genéticamente homogénea y es denominada clon, colonia o cultivo puro. Entonces, un medio de cultivo es un sustrato natural o artificial o una solución de ciertos nutrientes que permiten cultivar los microorganismos de una manera más eficiente para su posterior uso en el laboratorio. 3.1.CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: 3.1.1.   De acuerdo a la consistencia o estado físico:    Medios líquidos : Son medios de cultivo que carecen de un polisacárido denominado agar-agar extraído de algas marinas del género Gellidium sp. un medio típico es el caldo nutritivo o el caldo BHI. Al crecer en un medio líquido un microorganismo utiliza los compuestos del mismo así como excreta los productos metabólicos bacterianos en él y puesto que en el medio srcinalmente no contenía estos productos sirven como una ayuda  para la identificación del microorganismo en cuestión. Así ciertos microorganismos srcinan un producto denominado indol formado a partir de triptófano presente en la peptona por lo que cultivando estos  Universidad Nacional de Cajamarca Facultad Ciencias Agrarias E.A.P. Ingeniería de industrias alimentarias microorganismos en un medio rico en nitrógeno (peptona) y exento de indol pueden efectuarse pruebas con objeto de comprobar si el microorganismo cultivado es o no productor de indol.    Medios sólidos:  Estos medios son usados frecuentemente para aislar microorganismos, en los medios líquidos los microorganismos al encontrarse libres pueden desplazarse en tanto que en los medios sólidos se multiplican localmente en el punto de la inoculación y forman colonias cuya apariencia frecuentemente es típica de cada especie determinada. Para conseguir medios sólidos se agrega a un medio líquido agar en una  proporción del 1.5% al 2%. Hoy en día se presenta en forma de polvo que incluye el agar, el punto de fusión de estos medios oscila alrededor de los 98ºC y se solidifica al enfriarse al 42-45ºC. Los fluidos orgánicos como la sangre o el suero sanguíneo que coagulan a 60ºC deben ser incorporados antes de que se solidifique el agar (por Ej. A 50ºC). La gelatina también  puede emplearse como agente solidificante, se trata de una proteína obtenida a partir del colágeno de la piel, cuero, tendones, y huesos y forma un gel de buenas características a concentraciones de 12-15% en caldo nutritivo siendo su punto de fusión de 22ºC quedando destruidas sus  propiedades al alcanzar temperaturas por encima de 100ºC. Muchas  bacterias producen fermentos proteolíticos y su capacidad de licuar la gelatina se utiliza para clasificar los microorganismos con facultad de  producir la licuefacción cuando crecen a 37ºC o a temperaturas de laboratorio.Una variante de los medio sólidos son los medios condensados  preparados a partir de materias coagulables como el suelo o la albúmina de huevo y condensados en forma de pico de flauta a temperaturas cuidadosamente controladas en la zona de los 75ºC.    Medio semisólidos:  son medios que usualmente contienen una pequeña cantidad de agar, esta cantidad promedio es de 0.5%, estos medios son muy usados para determinar la movilidad de un microorganismo gracias a su escaso poder retenedor, es decir, que no impiden que el microorganismo móvil se desplace por el medio. 3.1.2.   Según las sustancias primarias los medios de cultivo se pueden clasificar en:    Medios naturales:  son aquellos medios empleados tal como se encuentran en la naturaleza para cultivar microorganismos, como ejemplo de estos medios encontramos la leche, los extractos vegetales o la sangre diluida.    Medios sintéticos:  como su nombre lo indica son medios que han sido creados por el hombre y por lo tanto se conoce su formulación completamente, son utilizados para el cultivo de microorganismos coincidiendo de antemano los requerimientos nutricionales que estos organismos necesitan. Como ejemplo podemos mencionar todos los medios deshidratados que distribuyen la casa comercial.      Medios semisintéticos:  son medios de cultivo que llevan una mezcla de medio naturales y medios artificiales, ya que algunos de los componentes
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x