Documents

METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTÉRIAS EM CÉLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATÓRIO

Description
OTA N OTA TÉCNICA METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTÉRIAS EM CÉLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATÓRIO METHODOLOGY TO CYANOBACTERIA CELLS COUNT IN CELLS/ML. A NEW CHALLENGE FOR THE LABORATORY ANALIST. FERNANDO ANTÔNIO JARDIM Mestrado em Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hídricos pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Biólogo, formado pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix; coordenador do setor de Biologia do Laboratório Metropolitano (L.M.)
Categories
Published
of 3
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Related Documents
Share
Transcript
  109 engenharia sanitária e ambiental NNNNN OTOTOTOTOTAAAAA TTTTT ÉCNICAÉCNICAÉCNICAÉCNICAÉCNICA M ETODOLOGIA   PARA   A   CONTAGEM   DE   CIANOBACTÉRIAS   EMCÉLULAS  /  ML . U M   NOVO   DESAFIO   PARA   O   ANALISTA   DE   LABORATÓRIO M ETHODOLOGY   TO   CYANOBACTERIA   CELLS   COUNT   IN   CELLS  /  ML . A NEWCHALLENGE   FOR   THE   LABORATORY   ANALIST . F  ERNANDO A  NTÔNIO J   ARDIM  Mestrado em Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hídricos pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Biólogo,formado pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix; coordenador do setor de Biologia do Laboratório Metropolitano(L.M.) da COPASA S  IMONI     DE O  LIVEIRA C   AVALIEREI  Bióloga, formada pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix, Belo Horizonte - MG; analista de laboratório do setorde Biologia do L. M. da COPASA.  P  ATRÍCIA C   ASTANHEIRA G  ALLINARI  Bióloga, formada pela Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG; analista de laboratório do setor deBiologia do L. M. da COPASA e mestranda do curso de Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hídricos da Escola deEngenharia da UFMG.  L  ENORA N. L UDOLF V   IANNA Mestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais; Bióloga, formada pela Universidade Federal de MinasGerais, Belo Horizonte - MG; pesquisadora autônoma do setor de Biologia do L. M. da COPASA. RESUMO O trabalho apresenta uma metodologia para a contagem decianobactérias (Cyanophyceae) em número de células por mililitrode amostra face à real necessidade exigida pela portaria no. 1469do Ministério da Saúde (12/2000) aos laboratórios dehidrobiologia das companhias de saneamento e institutos depesquisa no Brasil. Com o objetivo de se padronizar a contagemdas células de cianobactérias e facilitar a execução dos trabalhosrotineiros do laboratório, realizou-se uma adaptação ao cálculoda Unidade Padrão de Área (UPA), aceita internacionalmente.Após a padronização dessa contagem, a técnica foi então avaliadaatravés da aplicação nas análises de rotina, com resultadossatisfatórios.PALAVRAS-CHAVE: Cianobactérias, metodologia de contagemde células. ABSTRACT The paper presents a methodology to cyanobacteria cells count innumber per millilitre sampled due to real necessity demanded by new Brazilian drinking water regulation edict n. 1469 from Health Ministry 2000/12 to Brazilians sanitation companyhydrobiological departments and research institute, aiming thestandardisation the cyanobacteria´s cells counting and improve thelaboratory routine work. An adaptation to Area Standard Unit  (  ASU  )  , internationally accepted, was carried out. After the standard cells counting, this technique was then valued across the direct application in routine works with good results.KEYWORDS: Cyanobacteria , cells counting procedures . INTRODUÇÃO A partir da edição da portaria n o. 1469 do Ministério da Saúde em 12/ 2000 passou-se a exigir o monitoramentodas cianobactérias em águas deabastecimento, com o objetivo de quefossem implantados monitoramentossistemáticos para a tomada de açõespreventivas e corretivas que visassemminimizar os impactos à saúde humana,das toxinas produzidas por linhagens dealgumas espécies desses organismos. Essaexigência legal trouxe um grandedesconforto às companhias estaduais desaneamento, aos serviços autônomos e àsprefeituras pois, aliada à carência de setoreshidrobiológicos nos laboratórios dessesórgãos existia uma falta de padronizaçãodas metodologias utilizadas para aenumeração do fitoplâncton. De umamaneira geral, naqueles laboratórios ondese realizavam as análises hidrobiológicas,as unidades utilizadas para a expressãodo quantitativo eram aquelas jápadronizadas e propostas por órgãoscompetentes. Para tanto, pode-se citar aexpressão dos resultados em organismospor mililitro de acordo com A.P.H.A.(1998) ou por Unidade Padrão de Área(UPA/mL), cujo cálculo é didaticamenteexplicado pela CETESB (1978). Paraambos os casos a contagem era realizadaRecebido: 04/02/02 Aceito:07/08/02 Vol. 7- Nº 3 - jul/set 2002 e Nº 4 - out/dez 2002, 109-111  110 engenharia sanitária e ambiental   Figura 1 - Retículo de Whipple com uma colônia de cianobactéria    sobreposta  Tabela 1 - Procedimento operacional padrão para a contagem do número de célulasde cianobactérias em amostras de água. EtapasColônias de CianobactériasTricomasAntes da contagemMédia do número de células (em 30 colôniasaleatórias) contadas no quadrado maior do RW.Média do número de células em 30 tricomasaleatórios.Durante a contagemContar quantos quadrados maiores do RW sesobrepõem às colônias encontradas.Contar os tricomasEstimativa donúmero de célulasMultiplicar o número de quadrados maiorescontados pela média do número de células.Multiplicar a média do número de célulaspor tricoma pelo número de tricomascontados. segundo o critério da contagem por con- juntos ou clump counting (BRANCO,1986), entendendo-se por conjunto aunidade característica do gênero, isto é:uma célula, no caso de seres unicelulareslivres; uma colônia, no caso deunicelulares coloniais; um filamento outricoma no caso de cianobactériasfilamentosas. A referida portaria emquestão mencionava que o resultado paraas cianobactérias passasse a ser expressoem número de células por mililitroamostrado. Além disso, um pouco antesda publicação da legislação brasileira quesubstituiu a portaria no. 036 (01/90),CHORUS & BARTRAM (1999)elaboraram uma série de recomendaçõesoperacionais para se monitorar a presençade cianobactérias na água aonde aexpressão dos resultados é dada emnúmero de células por mililitro ou pelobiovolume. Criou-se o seguinte impasse:como manter toda uma rede demonitoramento e tomar medidasoperacionais se os resultados das análisesnão eram expressos em número de célulaspor mililitro? JARDIM (1999) fez umaadaptação ao cálculo da unidade padrãode área, aceita internacionalmente eaplicou nos seus trabalhos rotineiros nolaboratório metropolitano da companhiade saneamento de Minas Gerais comresultados satisfatórios. METODOLOGIA JARDIM (1999) levou emconsideração para aplicar o novo métodoo extenso intervalo da margem de erroproposta pela metodologia da contagemestimativa (A.P.H.A., 1998) que possuium limite de confiança de 95 ± 20%quando se contam 100 organismos daespécie predominante. Sendo que esseerro cai para 10% quando se contam 400indivíduos da espécie predominante deacordo com a distribuição de Poisson, cujafórmula é apresentada na equação 1: ( ) 2100%  N  (1)onde:  N  é o número de organismoscontados da espécie predominante.Os passos para a utilização dametodologia foram os seguintes: para ascolônias de  Microcystis ou outrascianobactérias da família Chroococcaceae,contou-se quantas células estavamcontidas num quadrado maior do retículode Whipple (R.W) ao se sobrepor pelomenos 30 colônias encontradasaleatoriamente no aumento de 200 vezes.Calculou-se a seguir uma média aritméticado número de células contadas. Durantea contagem, utilizando o mesmo aumento,contou-se quantos quadrados maiores doRW se sobrepunham às colôniasencontradas e para se estimar o númerode células, bastou multiplicar o númerode quadrados maiores contados, pelamédia do número de células contadasanteriormente. Já para as cianobactériasfilamentosas (tricomas) contou-se aquantidade de células em pelo menostrinta tricomas encontradosaleatoriamente na amostra. Em ambos oscasos, tanto para a contagem do númerode células nas colônias quanto nostricomas, procurou-se contar um númerototal por volta de 400 células, pois dessaforma, de acordo com a distribuição dePoisson, o limite de confiança foi de ±10%. A contagem das células para apadronização foi realizada por trêsdiferentes analistas de laboratório. NaFigura 1 observa-se um desenhoesquemático da sobreposição de umacolônia em forma de cocos no retículo deWhipple. RESULTADOS A aplicação da metodologia gerou oseguinte procedimento descrito na Tabela1.Após a realização de váriosexperimentos verificou-se que o númerode células nos tricomas ou nas colônias(enumeradas dentro de um dos quadradosmaiores do RW) não sofria grandealteração e além disso, o grau de liberdadedo intervalo proposto era muito amplo    N   N   N   N   N    O   T   O   T   O   T   O   T   O   T   A   A   A   A   A     T    T    T    T    T     É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A Vol. 7 - Nº 3 - jul/set 2002 e Nº 4 - out/dez 2002, 109-111 Jardim, F.A. et al  111 engenharia sanitária e ambiental Endereço paracorrespondência: Fernando Antônio Jardim  Companhia de Saneamento de Minas Gerais - COPASABr 356 - Km 4 - Cercadinho CEP: 31950-640 Belo Horizonte - MG Tel.: (31) 3250-2340 fjardim@copasa.com.br  (± 20% para as análises de rotina). Atra-vés dos resultados das contagens entre ostrês analistas de laboratório obtiveram-seas médias aritméticas do número de célu-las por tricomas ou colônias apresentadasna Tabela 2. DISCUSSÃO Apesar do extenso intervalo de con-fiança permitido pela metodologia (±10%) alguns cuidados devem ser toma-dos para se evitar que haja a extrapolaçãodesse intervalo. De preferência, a conta-gem das células para a padronização, de-verá ser feita sempre que possível com omaterial in vivo , pois em amostras fixa-das ou coradas as células modificam a suaforma e o tamanho podendo assim ocor-rer uma superestimação no momento dacontagem de amostras nos trabalhos roti-neiros. O contrário também pode ocor-rer, quando se contam indivíduos deamostras cultivadas, onde as células apa-recem em número e tamanho maiores doque as de amostras naturais, nesse casso,pode ocorrer uma subestimação no mo-mento da contagem das amostras de roti-na.As amostras deverão ser semprecoletadas na superfície dos mananciais,devendo-se evitar a coleta em profundi-dade ou após a saída de estações elevatóriasde água bruta (EEAB), essas amostras, aomicroscópio, apresentaram colônias im-pregnadas de partículas, o que dificulta acontagem das células. Além disso, a pre-sença de tricomas já partidos ou até mes-mo hormogônios interferem no resulta-do final.O aumento utilizado para a conta-gem das células no presente trabalho foide 200 vezes, mas para a contagem decélulas menores como de algumasChroococcaceae utilizou-se aumentosmaiores, mas para isso, as contagens dasamostras nos trabalhos de rotina foramrealizadas no mesmo aumento utilizadopara se contar as células nas colônias. Omesmo procedimento foi utilizado parase contar as células das formas tricomiais(filamentosas) com células mais largas quelongas (que lembram botões de camisasobrepostos) de algumas Oscillatoriaceae,mas nesse caso, depois que foi feita a pa-dronização do número de células portricoma, a dimensão do aumento utiliza-do não interferiu em nada ao se contar ostricomas nas amostras dos trabalhos derotina. Outro fator que interferiu muitodurante a contagem das células para apadronização foi a sobreposição das mes-mas, mas quando se contou somente oque estava dentro do quadrado maior doRW, essa interferência foi menor.Durante a contagem das amostrasde rotina, desde que tenha-se realizadoum exame qualitativo à contento, é pos-sível contar separadamente espécies de ummesmo gênero, cuja diferença entre onúmero de células ultrapasse os ± 10%,permitido pela metodologia, caso contrá-rio o resultado poderá ser expresso emgênero. Observou-se também durante otrabalho que as células podem modificarde tamanho e quantidade nas colôniasou nos tricomas de acordo com variaçõessazonais, por isso, recomenda-se que apadronização proposta seja realizada pelomenos duas vezes ao ano, uma na estaçãoseca e fria e outra na estação quente e chu-vosa, para países de clima predominante-mente tropical como o Brasil. CONCLUSÕES A metodologia proposta é passívelde ser aplicada em laboratórios dehidrobiologia podendo sofrer modifica-ções de acordo com as condições de cadalaboratório, mas sugere-se a observaçãodas considerações feitas acima, pois atra-vés delas, foi possível uma adaptação rá-pida ao que é exigido pela portaria no.1469 do Ministério da Saúde ou seja,expressar os resultados em número decélulas por mL e promover as medidascabíveis de freqüência de monitoramentoe ações operacionais preventivas a fim dese minimizar os efeitos causados pelascianotoxinas em águas de abastecimento. REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS AMERICAN PUBLIC HEALTHASSOCIATION. Standard methods for theexamination of water and wastewater  . 20. ed. Wa-shington: APHA/WEF/AWWA , 1998.BRANCO, S. M.  Hidrobiologia aplicada à engenha-ria sanitária . 2. ed. São Paulo: CETESB, 1986. 620p.BRASIL .  Ministério da Saúde - Portaria no. 36/GM- 01/90 - Diário Oficial, 23/01/1990.BRASIL .  Ministério da Saúde - Portaria no. 1.469 -12/2000 - Diário Oficial, no. 35-E, 19/02/2001.CETESB  , NT 06: L5. 303 . Determinação defitoplâncton de água doce - métodos qualitativo equantitativo. São Paulo, 1978.CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic Cyanobacteriain water: a guide to public health consequences,monitoring and management. World HealthOrganization . London and New York, 1999. 416p.JARDIM, F. A. Implantação e realização de análisesde cianotoxinas com avaliação do potencial tóxico emestações de tratamento da COPASA MG. BeloHorizonte, 1999.  Dissertação de Mestrado   -Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental- Escola de Engenharia - Universidade Federal deMinas Gerais.    N   N   N   N   N    O   T   O   T   O   T   O   T   O   T   A   A   A   A   A     T    T    T    T    T     É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A    É   C   N   I   C   A Vol. 7 - Nº 3 - jul/set 2002 e Nº 4 - out/dez 2002, 109-111 Tabela 2 - Cianobactérias catalogadas com a média do número de célula encontrada± 10% em microscópio invertido no aumento de 200 vezes por ocalidade. CianobactériasLocalidades emMinas GeraisMédia do número de células encontrada ± 10%  Anabaena planctonica Pitangui25 por tricoma  Anabaena circinalis São Simão98 por tricoma  Anabaena spiroides Pitangui102 por tricoma  Radiocystis fernandoi Betim20 por quadrado maior do RW  Microcystis panniformis Betim40 por quadrado maior do RW Cylindrospermopsisraciborskii Pedra Azul10 por tricoma  Aphanizomenon sp. Três Marias13 por tricoma Contagem de cianobactérias
Search
Tags
Related Search
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks
SAVE OUR EARTH

We need your sign to support Project to invent "SMART AND CONTROLLABLE REFLECTIVE BALLOONS" to cover the Sun and Save Our Earth.

More details...

Sign Now!

We are very appreciated for your Prompt Action!

x